醇沉4组分芦荟多糖通过不同给药途径对SD大鼠深Ⅱ度烫伤创面愈合过程中纤维连接蛋白含量的影响

何洁++唐建红++刘川玉+++冯熙++黄瑶

[摘要] 目的 研究醇沉4组分芦荟多糖对SD大鼠深Ⅱ度烫伤创面修复过程中皮肤愈合率及皮肤组织中纤维连接蛋白（FN）含量的影响，探讨芦荟多糖促进烫伤创面愈合的可能作用机制。 方法 大鼠背部用水浴烙铁法致伤，采用随机数字表法对大鼠分组。试验组用醇沉4组分（60%、70%、80%、90%比例）芦荟多糖水溶液采取外敷、灌胃及混合给药3种方式，对照组用生理盐水采取相同给药方式，2次/d。记录伤后3、7、14 d创面愈合率，应用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定创面皮肤组织中FN含量。 结果 与对照组比较，试验组愈合率明显升高，80%、90%芦荟多糖组于烫伤后14 d創面愈合率明显高于对照组（P < 0.01）。FN含量在第7天达峰值，之后逐渐下降。伤后3、7、14 d试验组创面FN含量均高于对照组，80%、90%芦荟多糖组FN含量于第7、14天显著高于对照组（P < 0.01），80%芦荟多糖组FN含量最高。给药方式上外敷优于灌胃，混合给药优于外敷给药。 结论 80%芦荟多糖混合给药（外敷及灌胃）烫伤大鼠，促进伤口愈合的疗效最佳。芦荟多糖使烫伤创面皮肤组织中FN含量增加，促进创面皮肤愈合，为芦荟多糖制剂在烧烫伤方面的临床应用提供了实验依据。

[关键词] 芦荟多糖；醇沉；给药途径；烫伤创面；愈合；纤维连接蛋白；含量

[中图分类号] R644 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）04（b）-0022-04

[Abstract] Objective To study the effects of aloe polysaccharide in four components of alcohol precipitation on the healing rate of skin and the contents of fibronectin （FN） during healing process in SD rats with scalded wound surface of deep Ⅱ degree， and to investigate the possible mechanism of aloe polysaccharide in promoting the healing of scalded wound surface. Methods The back of rats was injured by iron in boiling water， and the rats were grouped by random digits table. Experimental group was applied with aloe polysaccharide aqueous solution in four components of alcohol precipitation （60%， 70%， 80% and 90%）， with 3 administration routes of external application， gastrogavage and mixing administer； control group was applied with physiological saline by the same administration routes， twice a day. The healing rate of wound surface was recorded after scalding for 3， 7， 14 d， and the content of FN in wound surface was determined by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）. Results Compared with control group， the healing rate in experimental group was increased significantly， and the healing rates in 80%， 90% aloe polysaccharide groups after scalding for 14 d were significantly higher than that of control group （P < 0.01）. The contents of FN reached peak in seventh day， then they were gradually decreased. The contents of FN in wound surface after scalding for 3， 7， 14 d in the experimental group were all higher than those of control group， the contents of FN in 80%， 90% aloe polysaccharide groups after scalding for 7， 14 d were significantly higher than that of control group （P < 0.01）， the content of FN in 80% aloe polysaccharide group was the highest. In way of administration， external application was better than gastrogavage， and mixing administer was better than external application. Conclusion The efficacy of 80% aloe polysaccharide by mixing administer （external application， gastrogavage） in scalded rats in promoting the healing of wound is the best. Aloe polysaccharide makes the increase of FN in scalded wound surface， promote the healing of wound surface， and provide experimental basis for the clinical application of aloe polysaccharide preparations in burn and scald.

[Key words] Aloe polysaccharide； Alcohol precipitation； Administration routes； Scalded wound surface； Healing； Fibronectin； Content

开发既能消炎止痛、抗感染、促进创面愈合且愈后瘢痕少，又经济便宜、操作方便的外用药物，成为目前临床上烧烫伤创面治疗的重点。芦荟是多年生百合科肉质草本植物，具有良好的抗炎[1]、抗氧自由基[2]、调节免疫[3]、促进创伤愈合[4]、抗细菌[5]、抗真菌[6]、抗病毒[7]及抗辐射[8]、抗癌[9]等作用，广泛用于治疗烧烫伤、创伤。芦荟多糖为主要生物活性成分，可刺激免疫，激活巨嗜细胞产生[10]，分泌多种细胞因子如表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、核因子等[11]；促进内皮细胞迁移、增殖并影响受损内皮细胞修复[12]，促进伤口愈合。研究发现芦荟凝胶对Ⅱ度烫伤大鼠具有促进创面愈合和减少瘢痕形成的作用[13]。本研究通过建立大鼠深Ⅱ度烫伤模型，按鲜榨汁法制备库拉索芦荟凝胶中醇沉4组分芦荟多糖水溶液采取外敷、灌胃及混合给药3种方式，观察大鼠烫伤创面愈合率及皮肤组织中纤维连接蛋白（FN）含量，探讨芦荟多糖促进烫伤创面愈合的作用机制，为芦荟多糖制剂在烧烫伤方面临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级SD大鼠450只，成年（12月龄），雌雄各半，体重（200±20）g，由桂林医学院科学实验中心动物室提供（桂动字第P0020500A號）。严格遵循科技部《关于善待实验动物的指导性意见》，经桂林医学院实验动物伦理委员会批准实施。

1.2 药品与试剂

芦荟多糖，采用百合科芦荟属植物库拉索芦荟去皮取肉质部分按鲜榨汁法提取，醇沉法制备。库拉索芦荟品种来源于桂林医学院药用植物园，经桂林医学院生药教研室唐爱莲教授鉴定为正品。大鼠FN酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（SBJ，96T，PD-7002）购自南京安培化工科技有限公司。

1.3 仪器

电子天平（HK-7532，瑞士Mettler公司）；振荡器（B0025，上海医科大学仪器厂）；组织粉碎机（JB90-D，上海标本模型厂）；旋转蒸发仪（C0034，上海医科大学仪器厂）；快速恒温数显水浴箱（JK-56，常州国华仪器厂）；-80℃超低温冰箱（M-6200，日本Sanyo公司）；自动高速低温离心机（J6-HC，美国Beckman公司）；酶标仪（K-6010，美国Bio-Tek公司）。

1.4 方法

1.4.1 芦荟多糖水溶液制备

鲜榨汁法[14]制备芦荟凝胶。取新鲜库拉索芦荟叶，洗净沥干剪成长条状并去皮，取叶肉用组织粉碎机打成胶状，称定质量，将芦荟凝胶置于烧杯中加3倍量蒸馏水，0.5%活性炭脱色，超声30 min后60℃水浴30 min，6层纱布过滤后减压抽滤。滤液置旋转蒸发仪中浓缩至原体积1/5，加0.2%～0.5%抗氧化剂Na2SO3防止氧化。

运用醇沉法[15]按60%、70%、80%、90%比例提取芦荟凝胶中的芦荟多糖。将制备好的新鲜芦荟凝胶各4份，3倍量蒸馏水于60℃水浴30 min充分溶解，减压抽滤，滤液分别用无水乙醇配成料液比为1∶1.50、1∶2.33、1∶4.00、1∶9.00的芦荟凝胶-乙醇混合溶液，静置过夜，得白色絮状沉淀。倾去上清液，取下层混合液于60℃水浴蒸干，将所得物质再次加水复溶，重复操作，研磨得到白色均匀细腻的粉末，即醇沉4组分的芦荟多糖，蒸馏水溶解配制成浓度为10 mg/mL芦荟多糖水溶液，冷藏备用。

1.4.2 大鼠烫伤模型建立

大鼠腹腔麻醉，背部脱毛消毒，将开水浴中煮沸铁棒（横断面1.5 cm×1.0 cm）一端紧贴大鼠背部皮肤持续7 s，造成约10%面积烫伤，创面病理证实为深Ⅱ度，腹腔注射乳酸林格液5 mL抗休克。因背部烫伤部位大鼠未能舔食触及和搔抓，故将烫伤创面开放以随时观察创面愈合或感染情况。于室温22～25℃、湿度50%单笼饲养，自由摄食、饮水。

1.4.3 实验分组及给药方法

采用随机数字表法将450只SD大鼠随机分成对照组（90只）和试验组（360只）。试验组即芦荟多糖组，随机分为60%、70%、80%、90%芦荟多糖组，每组90只，按外敷、灌胃（每次10 mL）及混合（外敷及灌胃）3种给药方式（2次/d），分为三小组，每小组30只。试验组均按“1.4.1”法配制10 mg/mL芦荟多糖水溶液给药，对照组用与试验组等体积的生理盐水采取相同给药方式，如有感染用抗生素外涂。

1.4.4 标本处理

五组大鼠分别于烫伤后3、7、14 d每小组处死10只。取创面全层皮肤组织100 mg，去除痂皮并吸去血迹，按1 mL生理盐水/100 mg皮肤组织比例碾磨匀浆。将标本于4℃以下10 000 r/min（r = 13.5 cm）离心15 min，取上清液于-20℃以下保存。

1.5 检测指标

1.5.1 创面愈合率

烫伤后3、7、14 d记录创面愈合程度，将创面描记在半透明纸上，以此为模板，将质地均匀的硬纸片剪成同样大小，以硬纸片大小间接表示创面面积大小。创面愈合率（%）=（开始烫伤面积-未愈合创面面积）/开始烫伤面积×100%。

1.5.2 FN含量

取烫伤后3、7、14 d烫伤部位皮肤称重、定容、匀浆，测定组织液中FN含量，采用ELISA双抗夹心法检测。

1.5.2.1 建立标准曲线 设标准孔10孔，1、2孔分别加标准品100 μL及稀释液50 μL，依次混匀、对倍稀释至9、10孔，稀释后各孔加样量均为50 μL，于450 nm波长处测吸光度。取每2孔平均值，以浓度C为横坐标，吸光度A（OD值）为纵坐标，绘制标准曲线。得回归方程A = 0.0236C+0.252，R2 = 0.9947。见表1、图1。

1.5.2.2 结果测定 设空白对照孔（不加样品及酶标试剂）、待测样品孔，按加样、温育、配液、洗涤、加酶、温育、洗涤、显色、终止步骤操作。以空白对照孔调零，于450 nm波长处依序测定每孔吸光度（OD值），将样本OD值代入标准曲线方程，求出浓度，样品浓度×稀释倍数=样品的实际浓度。

1.6 统计学方法

采用SPSS 19.0软件分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）及方差齐性检验，方差齐采用LSD检验，方差不齐采用Tamhane's T2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组烫伤创面愈合率比较

烫伤后第3天各组间差异无统计学意义（P > 0.05），第7天80%、90%芦荟多糖组愈合率明显高于对照组（P < 0.05），第14天60%、70%芦荟多糖组愈合率高于对照组（P < 0.05），80%、90%芦荟多糖组愈合率显著高于对照组（P < 0.01）。试验各组组间差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

2.2 各组烫伤创面皮肤组织纤维连接蛋白含量变化比较

烫伤后各组FN含量随着时间的延长而逐渐增加，烫伤后第7天达高峰，试验组FN含量均高于对照组，80%芦荟多糖组FN含量最高。给药方式上外敷优于灌胃，混合给药优于外敷给药。烫伤后第3天，80%、90%芦荟多糖组FN含量明显高于对照组（P < 0.05）；烫伤后第7、14天，60%、70%芦荟多糖组FN含量高于对照组（P < 0.05），80%、90%芦荟多糖组FN含量显著高于对照组（P < 0.01）。试验各组组间差异无统计学意义（P > 0.05）。见表3。

3 讨论

烫伤创面修复愈合受多种因素影响，早期与局部炎性反应，后期与上皮细胞增殖、结缔组织形成、伤口收缩改建有关[16-17]。FN促进细胞与纤维基质间连接生长，与创伤修复过程密切相关，为伤口愈合关键物质[18-19]。芦荟多糖促进FN合成，加速胶原蛋白生物合成降解，使伤口愈合加速[20]。

与对照组相比，试验组烫伤创面愈合时间明显缩短，烫伤后第7、14天愈合率明显提高（P < 0.05）。试验组FN含量明显高于对照组，表明芦荟多糖给药促进烫伤创面皮肤组织内FN合成，达到愈合创面皮肤作用。80%芦荟多糖组混合给药FN含量最高，研究表明[21]，芦荟凝胶中多糖含量与醇沉比例呈正相关，但并非比例越大越好，以80%醇沉组多糖含量最高，故促进创面愈合疗效最佳。FN含量于烫伤后第7天达到峰值，之后逐渐下降。由于烫伤早期损伤修复由肉芽组织即新生毛细血管和纤维母细胞修复，烫伤晚期肉芽组织中毛细血管成熟并减少，纤维母细胞转变为纤维细胞并产生胶原纤维[22]，因此芦荟多糖在烫伤早期促进组织修复，烫伤晚期由于组织修复较快，加速肉芽组织形成和老化而减少瘢痕形成，FN含量下降。

总之，芦荟多糖促使烫伤创面皮肤组织中FN含量增加，加速创面皮肤愈合，以80%芦荟多糖混合给药（外敷及灌胃）方式促进愈合疗效最佳，为芦荟多糖制剂在烧烫伤方面的临床应用提供实验依据。

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（收稿日期：2017-01-03 本文编辑：张瑜杰）