响应面法优化超声辅助提取金银花中绿原酸

蒋美丽，久保辉幸(日)，王正裔，郭 嘉

(武汉工程大学化工与制药学院 绿色化工过程教育部重点实验室，湖北 武汉 430073)

响应面法优化超声辅助提取金银花中绿原酸

蒋美丽，久保辉幸(日)，王正裔，郭 嘉*

(武汉工程大学化工与制药学院 绿色化工过程教育部重点实验室，湖北 武汉 430073)

采用超声辅助乙醇从金银花中提取绿原酸，通过单因素实验考察pH值、料液比、乙醇体积分数和提取时间对绿原酸提取率的影响，采用响应面法优化提取工艺条件。确定最佳工艺条件为：pH值5.2、提取时间21 min、乙醇体积分数63%、料液比1∶13.5(g∶mL)。在该优化条件下，绿原酸的提取率达到10.862%。

金银花；绿原酸；响应面法；超声辅助提取

金银花(Lonicera japonica)为忍冬科植物，在我国分布广泛，具有较高的药用价值[1-2]。绿原酸具有杀菌、抗病毒等作用，广泛用于医药、保健、化工和食品等领域[3-5]。采用超声波法提取金银花中的绿原酸，不仅可以缩短提取时间，还能提高提取率[6-7]。响应面法(responsesurfacemethodology，RSM)是采用Design-Export优化软件进行实验设计与分析，用多元二次回归方程近似拟合实验中的多因素与指标之间的相互关系[8]，获得最优条件。商小金等[9]通过响应面法对中药延胡索中生物碱的提取工艺条件进行优化，获得较好的效果。作者采用超声辅助乙醇提取金银花中的绿原酸，采用响应面法优化工艺条件。

1 实验

1.1 材料与试剂

金银花，河南省密县。

绿原酸标准品、无水乙醇、浓盐酸、氢氧化钠、蒸馏水(实验室自制)。

1.2 方法

1.2.1 绿原酸标准曲线的绘制

精确称量5mg绿原酸标准品放入50mL容量瓶中，加70%乙醇定容，配制成标准溶液。分别精密吸取1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL标准溶液置于25mL容量瓶中，加70%乙醇定容，配制成不同浓度的系列绿原酸标准溶液。采用紫外分光光度计在200～400nm范围内扫描，测出绿原酸的最大吸收波长为328nm。在328nm波长处测定系列绿原酸标准溶液的吸光度，以吸光度A为纵坐标、浓度c为横坐标绘制标准曲线。

1.2.2 绿原酸提取率的计算

根据下式计算绿原酸的提取率：

式中：c为绿原酸浓度，μg·mL-1；V为样液体积，mL；n为提取液的稀释倍数；m为样品质量，g。

1.2.3 单因素实验

将金银花打磨成粗粉。准确称取2.5 g金银花粗粉置于250 mL锥形瓶中，加入适量一定体积分数的乙醇溶液。将锥形瓶置于超声波清洗器中提取绿原酸，抽滤，收集滤液，测定绿原酸含量。

分别取pH值3～8、乙醇体积分数50%～90%、料液比1∶(6～14)(g∶mL，下同)以及提取时间10～50 min进行单因素实验。

1.2.4 响应面法实验

根据单因素实验结果，选择影响绿原酸提取效果比较显著的4个因素：pH值、料液比、乙醇体积分数和提取时间为考察对象，以绿原酸提取率(Y)为响应值进行响应面优化实验，其因素与水平见表1。

表1 响应面法实验的因素与水平

Tab.1 Factors and levels of RSM experiment

2 结果与讨论

2.1 绿原酸的标准曲线(图1)

根据图1拟合绿原酸的回归方程：A=0.03187c-0.01272(R2=0.99905)，绿原酸的吸光度在4～24μg·mL-1的浓度范围内表现出较好的线性关系。

图1 绿原酸的标准曲线

2.2 单因素实验结果

2.2.1 pH值的影响(图2)

图2 pH值对绿原酸提取率的影响

由图2可知，绿原酸的提取率随着pH值的增大先升高后降低，在pH值为5时提取率最高。这是因为，在碱性条件下绿原酸发生了水解，导致提取率降低。因此，pH值取5较适宜。

2.2.2 乙醇体积分数的影响(图3)

图3 乙醇体积分数对绿原酸提取率的影响

由图3可知，绿原酸提取率随着乙醇体积分数的增大先升高后降低，乙醇体积分数达到70%时提取率最高。这是因为，不同体积分数的乙醇对金银花中有效成分的解析能力不同，过高会增加醇溶性杂质的溶出，过低会减少绿原酸的溶出。因此，乙醇体积分数取70%较适宜。该结论与肖卓炳等[10]的结论一致。

2.2.3 料液比的影响(图4)

图4 料液比对绿原酸提取率的影响

由图4可知，随着料液比的减小(即溶剂量的增加)，绿原酸的提取率逐渐升高；当料液比为1∶12时，提取率达到最高；继续减小料液比，绿原酸的提取率反而下降。这是由于，在相同的超声加热时间内，体系的溶剂量大，温度就比较低，影响溶质在溶剂中的扩散，提取率降低。因此，料液比取1∶12较适宜。

2.2.4 提取时间的影响(图5)

图5 提取时间对绿原酸提取率的影响

由图5可知，随着提取时间的延长，绿原酸的提取率先升高后降低，在30 min时达到最高。这是因为，随着提取时间的延长，提取液中的杂质会大量增多，绿原酸的提取率降低。因此，提取时间取30 min较适宜。

2.3 响应面法实验结果

2.3.1 响应面法实验设计方案

根据Box-Behnken中心组合实验设计原理，共进行29个实验点的响应面实验，结果见表2。

表2 响应面法实验结果

Tab.2 Results of RSM experiment

2.3.2 响应面法实验结果的方差分析(表3)

表3 响应面法实验结果的方差分析

Tab.3Variance analysis of RSM results

注：*表示差异在0.05水平上显著；**表示差异在0.001水平上非常显著。

从表3可知，模型的P<0.0001，说明回归方程非常显著；模型的相关系数R2=0.9653，表明实验中96.53%的数据是合理的；失拟项F=1.44、P=0.3862，大于0.01不显著，表明方程具有很好的模拟性；变异系数0.52%小于10%，表明该模型的可信度和精确度高；方程的精密度等于21.643，大于4视为合理[11]，所以此模型是合理的，适应性较好，可以用于该实验。

2.3.3 响应面图分析

根据二元回归方程生成等高线图和三维响应面曲线，各因素之间的交互作用可以被直观反映，见图6～图9。

从图6、8、9中可以看出，X1X2、X1X4、X2X3之间的交互作用不明显。从图7可以看出，等高线中心呈椭圆形，则X1X3之间的交互作用较明显。该实验的响应面图均开口向下，4个制约因素和提取率呈抛物线关系，在实验范围内出现最大值。采用软件优化，获得最佳实验条件：pH值5.22、提取时间21.28 min、乙醇体积分数62.90%、料液比1∶13.55，绿原酸提取率的理论预测值为10.858%。

2.4 响应面验证实验

考虑到实际操作，验证实验时将最佳条件修正为：pH值5.2、提取时间21 min、乙醇体积分数63%、料液比1∶13.5。利用修正后的实验条件进行3次平行实验，绿原酸平均提取率为10.862%，和理论预测值相对误差为0.037%，差异不显著，表明响应面法确定的实验条件是稳定可行的。

图6 pH值和料液比对绿原酸提取率的交互影响

图7 pH值和乙醇体积分数对绿原酸提取率的交互影响

图8 pH值和提取时间对绿原酸提取率的交互影响

图9 料液比和乙醇体积分数对绿原酸提取率的交互影响

3 结论

通过单因素实验和响应面法实验确定金银花中绿原酸超声辅助提取的最佳工艺条件为：pH值5.2、提取时间21 min、乙醇体积分数63%、料液比1∶13.5(g∶mL)。在该条件下绿原酸的提取率达到10.862%。该优化工艺模型准确可靠，提取率较高，具有现实指导意义。

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Optimization of Ultrasonic-Assisted Extraction of Chlorogenic Acid fromLoniceraJaponicaby Response Surface Methodology

JIANG Mei-li，Teruyuki KUBO (Japan)，WANG Zheng-yi，GUO Jia*

(KeyLaboratoryforGreenChemicalProcessofMinistryofEducation，SchoolofChemicalEngineeringandPharmacy，WuhanInstituteofTechnology，Wuhan430073，China)

ChlorogenicacidfromLonicera japonicawasextractedusingultrasonic-assistedethanol.TheeffectsofpHvalue，solid-liquidratio，ethanolvolumefractionandextractiontimeontheextractionrateofchlorogenicacidwasdiscussedbyasinglefactorexperiment，andtheextractionconditionswereoptimizedbyresponsesurfacemethodology.Theoptimumconditionswereasfollows:pHvalue5.2，extractiontime21min，ethanolvolumefraction63%，solid-liquidratio1∶13.5(g∶mL).Undertheoptimumconditions，theextractionrateofchlorogenicacidreached10.862%.

Lonicera japonica；chlorogenicacid；responsesurfacemethodology；ultrasonic-assistedextraction

教育部“新世纪优秀人才支持计划”(NCET-05-0681)，武汉工程大学第10期大学生校长基金资助项目(2015017)

2016-10-26

蒋美丽(1990-)，女，河南永城人，硕士研究生，研究方向：天然产物分离与提取；

郭嘉，湖北省“楚天学者”计划特聘教授，博士生导师，E-mail：guojia@wit.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.03.009

TQ461 R284.2

A

1672-5425(2017)03-0035-05

蒋美丽，久保辉幸(日)，王正裔，等.响应面法优化超声辅助提取金银花中绿原酸[J].化学与生物工程，2017，34(3)：35-39，44.