一种复方口服美容液的抗衰老作用及毒理学实验研究

谢晓辉，朱 瑶，窦智燕，陈健文，徐巨才

•论 著•

一种复方口服美容液的抗衰老作用及毒理学实验研究

谢晓辉1，朱 瑶1，窦智燕1，陈健文1，徐巨才2

（1.中山大学药学院 广东 广州 510006；2.华南理工大学轻工与食品学院 广东 广州 510640）

目的：探究一种中草药组方口服液的美容功效及其毒理学安全性。方法：采用D-半乳糖联合光照诱导裸鼠皮肤衰老模型，评价该组方对皮肤衰老的改善作用；通过小鼠经口亚急性毒性实验，连续喂食14d，对组方进行安全性评价。结果：本中草药组方口服液中、高剂量能有效增加皮肤透明质酸的含量，提高皮肤含水量，增加皮肤中胶原蛋白和弹性蛋白的含量，对皮肤病理学有改善作用；经口亚急性毒性实验可见有腹泻和体重稍减轻现象，但未见明显毒性及死亡。结论：本中草药组方口服液有一定延缓裸鼠皮肤衰老的功效，且未见明显毒性。

中药；抗皮肤衰老；光老化；D-半乳糖

皮肤衰老作为机体衰老的重要部分，常伴随着皮肤及其附属器官的萎缩、功能减退、皮肤干燥等现象[1]。皮肤衰老原因分为内在因素和外在因素，前者与年龄有关，而后者主要包括紫外线及空气污染，故面颈部、手臂等长期暴露的皮肤，最先显现出衰老表象[2]。目前对皮肤衰老的研究多基于自由基氧化损伤学说，该学说认为皮肤衰老与机体抗氧化、清除自由基的能力下降相关，并认为适量增加抗氧化物质、清除体内过量自由基可延缓皮肤衰老[3]。中药因富含酚类、萜类等天然抗氧化活性物质，故其在抗皮肤衰老的研究中越来越多。本文考察的组方由黄芪、玉竹、生地黄、玫瑰花提取物联合胶原蛋白、弹性蛋白肽、透明质酸组成。本研究采用D-半乳糖皮下注射联合紫外照射致裸鼠衰老模型，探讨组方对裸鼠皮肤衰老的改善作用；另设计连续喂食14d亚急性毒性实验，对组方进行安全性评价，为进一步开发抗皮肤衰老产品提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 中草药组方：由0.07g/ml黄芪、0.05 g/ml玉竹，0.05g/ml生地黄、0.025g/ml玫瑰花、0.12g/ml水解胶原蛋白、2.4mg/ml透明质酸钠及1.2mg/ml弹性蛋白肽组成的棕色浓缩液，其总生药含量为0.301g/ml；亚急性毒性实验样品生药含量为1.2g/ ml，口服液2～8℃密封避光保存。弹性蛋白肽是以牛韧带为原料，经前处理、酶解、喷雾干燥等工艺制得，其蛋白质含量≥90.0%，肽含量（以干基计）≥50.0%，其中相对分子量质量小于5000Da的蛋白质水解物所占比≥80.0%。

1.1.2 实验动物和环境：SPF级BALB/c-nu裸鼠，雄性，21～34d日龄，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供；SPF级昆明小鼠，体重18～22g，由广州中山大学实验动物中心提供；动物饲料为SPF级鼠灭菌饲料，由广东省医学实验动物中心提供。实验环境为：温度：20℃～25℃；湿度：40%～70%。

1.1.3 主要仪器和试剂：皮肤测试仪（型号：HKJ-SK03，HUNTKEY Company）、紫外线杀菌灯（型号：TUV36W，广州市博胜光电技术有限公司）、酶标仪（型号：ELX-800，美国BIOTEK）、匀浆机（型号：VCX 130PB，SONICS & MATERIALS INC）。皮肤Ⅲ型胶原蛋白试剂盒（批号：Q13137357）、透明质酸ELISA试剂盒（批号：Q09137359）、羟脯氨酸ELISA试剂盒（批号：Q20137358）、D-半乳糖（批号：101622565，sigma-Aldrich）均购自武汉华美生物工程有限公司。弹性蛋白ELISA试剂盒（批号：201511）、胶原蛋白ELISA试剂盒（批号：201511）均购自上海酶联生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 中草药组方口服液功效实验：裸鼠72只，随机分为6组，每组12只，分别为空白对照组（给予等量蒸馏水）、模型组（给予等量蒸馏水）、样品低剂量组（4.16ml/kg）、样品中剂量组（8.33ml/kg）、样品高剂量组（16.66ml/kg）、弹性蛋白肽阳性对照组（8.3mg/kg）。除空白组外，每组每日颈背部皮下注射5% D-半乳糖1000mg/kg，同时进行UV照射，波长为350～400nm，照射时间是40min/d，光源距鼠约40cm垂直高处；空白组每日颈背部皮下注射等体积的生理盐水，正常光照饲养。持续造模40d，于造模第11d开始，每组按剂量灌胃给予相应样品或蒸馏水，连续喂食30d。

每日观察裸鼠状态，每周定期用皮肤水分测定仪测定皮肤含水量。实验结束后，眼眶取血，分离血清用于检测血清透明质酸含量；处死裸鼠，取颈背部皮肤，除去皮下脂肪及其他结缔组织，部分皮肤加入9倍质量的预冷生理盐水制成10%组织匀浆，取上清液测定皮肤中透明质酸、胶原蛋白和弹性蛋白含量；部分皮肤放于80℃烘箱烘干24h，计算皮肤含水量=（干燥前质量 - 干燥后质量）/干燥前质量 ×100%；剩余组织HE染色，进行组织病理学检查。

1.2.2 中草药组方口服液经口亚急性毒性实验：SPF级昆明小鼠40只，雌雄各半，随机分成2组，每组20只，分为空白对照组及给药组。空腹15h后，灌胃给予0.4ml/10g口服液，喂食2h后供应水和饲料，各组喂食后立即观察动物的反应情况，连续喂食14d。观察内容包括动物饮食、行为、分泌物、排泄物的变化，记录动物的死亡情况、中毒症状及中毒反应的起始时间、持续时间、严重程度等。分别于喂食前，喂食后2d、3d、5d、7d、14d称量动物体重。

1.3 统计学分析：采用SPSS17.0统计软件进行数据分析，数据均以（x¯±s）表示，组间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 中草药组方口服液功效实验

2.1.1 一般状态观察：与空白对照组相比，模型组裸鼠随造模时间延长而活动减少、食欲下降、皮肤皱褶增加，各给药组与模型组比较症状均有所改善。

2.1.2 皮肤含水量：干燥法测定的皮肤含水量结果见表1，给药30d后，与模型组相比，样品中、高剂量组皮肤含水量显著升高（P＜0.01）。水分测定仪测定结果见表2，与模型组相比，样品高剂量组给药三周后皮肤水分升高（P＜0.05），给药四周后，样品中、高剂量组皮肤水分升高（P＜0.05）。以上结果提示本中草药组方口服液可能具有增加衰老裸鼠皮肤水分的功效。

2.1.3 血清及组织生化指标含量：血清及皮肤中透明质酸含量测定见表3，与空白对照组相比，模型组血清及皮肤组织中透明质酸含量显著降低（P＜0.01），说明造模成功。与模型组相比，样品中剂量组皮肤匀浆中透明质酸的含量显著提高（P＜0.05）；样品高剂量组裸鼠血清和皮肤匀浆中的透明质酸含量均有所提高（P＜0.05 or P＜0.01），以上结果提示本中草药组方口服液具有增加衰老裸鼠血清及皮肤中透明质酸的功效。皮肤中胶原蛋白和弹性蛋白含量的测定见表3，与空白组相比，模型组总胶原蛋白和弹性蛋白含量显著降低；与模型组相比，样品高剂量组能有效增加皮肤胶原蛋白和弹性蛋白的含量（P＜0.05），以上结果提示本中草药组方口服液具有增加衰老裸鼠皮肤中胶原蛋白和弹性蛋白的功效，其作用效果与弹性蛋白肽相当。

表1 各组裸鼠皮肤含水量测定结果 （x¯±s，n=12）

2.1.4 组织病理学检查：显微镜下观察HE染色，结果见图1，空白对照组的小鼠皮肤表皮层平整、角化层薄，真皮层无可见炎症细胞；而模型组的小鼠皮肤损伤较严重，其表皮层褶皱多、凹凸不平，部分表皮层变薄并且角化严重，真皮层可见炎症细胞浸润；与模型组对比，样品中剂量组和高剂量组表皮层褶皱少，表皮层增厚而角化层变薄，真皮层炎症细胞减少甚至无；另弹性蛋白肽组表皮层较平整，真皮层炎症细胞少，但角化较严重；提示中、高剂量中草药组方口服液具有缓解皮肤病理学损伤的功效。

2.2 中草药组方口服液经口亚急性毒性实验：样品组每天灌胃给予0.4ml/10g中草药组方口服液，喂食后3h内小鼠活动变少，部分小鼠有腹泻现象，但未见其他异常；2d后，部分小鼠臀部的毛发有轻微脱毛现象；喂食2d、3d、5d、7d、14d后的体重略低于空白对照组，但无统计学差异（P＞0.05），空白对照组未见明显异常，体重情况详见表4。

表2 各组裸鼠皮肤水分测定结果 （%，x¯±s，n=12）

表3 各组裸鼠生化指标测定结果 （x¯±s，n=12）

图1 裸鼠皮肤HE染色病理切片（×400）

表4 小鼠体重随喂食时间变化情况 （g，x¯±s，n=20）

3 讨论

皮肤衰老是由机体内在因素和外在环境因素共同作用下导致的，随着人们生活水平的提高，市场对于抗皮肤衰老相关产品的需求愈来愈迫切。目前抗皮肤衰老常见药物有：维生素C、E、辅酶Q等；而皮肤提紧术、肉毒素注射、激光治疗等也作为对抗皮肤衰老的手段[4]。随着现代医学技术和中药药理学研究的不断深入，中草药在抗皮肤衰老方面取得了很多突破性的进展，中医学理论认为，皮肤衰老是机体脏腑衰老的外在表现，内服中药调理五脏功能，可达到延缓皮肤衰老的疗效[5]。

本研究中的中草药组方由黄芪、玉竹、玫瑰花、生地黄提取物联合胶原蛋白、弹性蛋白肽、透明质酸组成。有研究表明黄芪具有益阳补气、托毒生肌、加快皮肤新陈代谢及延缓小鼠皮肤衰老的作用[6-7]；玉竹多糖可增强衰老模型小鼠的免疫功能，延缓小鼠衰老[8]；玫瑰花提取物能提高果蝇抗氧化系统自由基清除作用，降低体内脂褐素水平，具有延缓衰老、延长寿命的作用[9]；生地黄块根提取物具有较好的抗氧化活性，可清除氧自由基以防止机体衰老[10]。胶原蛋白口服可增强皮肤胶原活性[11]；弹性蛋白肽可增加皮肤中的弹性纤维含量，增加皮肤弹性[12]；口服透明质酸可增加由真皮至表皮内源透明质酸的含量，使皮肤具有一定的韧性和弹性[13]。本实验中经中草药组方口服液功效实验证明，本组方口可显著提高皮肤含水量，增加皮肤总胶原蛋白、弹性蛋白和透明质酸的含量，对延缓皮肤衰老具有积极作用。亚急性经口毒性实验中，喂食后3h内小鼠活动变少，部分小鼠有腹泻现象；2d后，部分小鼠臀部的毛发有轻微脱毛现象；体重略低于空白对照组，但无统计学差异，无死亡发生，未见明显毒性。综上所述，本中草药组方口服液具有一定改善皮肤衰老的功效，且口服安全。但本文对于该中草药组方对抗裸鼠皮肤衰老的机理机制尚未深入研究，需进一步完善。

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Experimental Research on Anti-Aging Effect and Acute Toxicity of a Compound Oral Liquid

XIE Xiao-hui1,ZHU Yao1,DOU Zhi-yan1,CHEN Jian-wen1,XU Ju-cai2
(1.School of Pharmaceutical Sciences, Sun Yat-Sen University,Guangzhou 510006,Guangdong,China; 2.School of Light Industry and Food,South China University of Technology,Guangzhou 510640,Guangdong,China)

traditional Chinese medicine; resist skin aging; photoaging; D-galactose

R339.3+8

A

1008-6455（2017）05-0035-04

2016-12-10

2017-04-29

编辑/张惠娟

陈健文，男，高级工程师，主要从事药品及保健食品的开发与评价；通信地址：广东省广州大学城外环东路132号中山大学药学院药理与毒理学实验室；E-mail：573016880@qq.com

谢晓辉，男，在读研究生，主要从事药品及保健食品评价

Abstract: Objective To study the cosmetic eff i cacy and toxicological safety of a Chinese herbal compound oral liquid. Methods D-galactose combined with ultraviolet light to induced skin aging model to evaluate the effect of the prescription on skin aging; The mice were fed with 14 d for subacute oral toxicity test to evaluate the safety of sample liquid. Results The middle and high dosage of the Chinese herbal compound oral liquid can effectively increase the content of hyaluronic acid in the skin, increase the skin water content, increase the content of collagen and elastin in the skin, and protect the skin morphology. The diarrhea and weight loss were observed, but no obvious toxicity and death. Conclusion The Chinese herbal formula oral liquid can improve the water retention capacity of skin, enhance skin elasticity, reduce skin wrinkles, delay skin aging, no obvious acute toxicity.