生川乌片炮制过程中5-HMF含量随炮制时间的变化规律研究

王蕾，张语凡，王鑫，彭诗涛，袁金凤，张先灵，陈炯，李飞*

(1.北京中医药大学，北京 100102；2.河北省中医院，河北 石家庄 050011)

生川乌片炮制过程中5-HMF含量随炮制时间的变化规律研究

王蕾1，张语凡1，王鑫1，彭诗涛1，袁金凤1，张先灵1，陈炯2，李飞1*

(1.北京中医药大学，北京 100102；2.河北省中医院，河北 石家庄 050011)

目的：考察生川乌片炮制过程中5-羟甲基糠醛(5-HMF)含量随炮制时间的变化规律。方法：按照2015版《中华人民共和国药典》(一部)制川乌项下的蒸与煮法，分别制备不同炮制时间的制川乌片，采用HPLC法测定川乌各炮制品中5-HMF的含量。结果：生川乌片中5-HMF含量为4.45 μg/g；煮制品及蒸制品在6 h之内，5-HMF的含量变化规律基本一致，均随加热时间延长呈非线性增加。在相同的时间点，蒸制品含量显著高于煮制品。 结论：首次建立了HPLC法测定川乌中5-HMF含量的方法，该法稳定、可靠；生川乌片在蒸、煮两种加热方式下5-HMF含量的变化规律与加热时间有关，该结果对川乌饮片中5-HMF的检测及其质量控制提供参考。

生川乌片；炮制；HPLC；5-羟甲基糠醛

川乌为毛茛科植物乌头(AconitumcarmichaeliiDebx．)的干燥母根，味辛、苦，性热，有大毒，归心、肝、脾经，具有祛风除湿、温经止痛功效[1]。川乌中主要含有生物碱类及多糖类成分。在炮制过程中，川乌中的多糖可能发生糖苷键的水解和糖的脱水反应，生成5-羟甲基糠醛(5-HMF)。目前，尚未见炮制对川乌中5-HMF影响的相关研究报道。因此，作者建立了川乌中5-HMF的含量测定方法，并对生川乌片及不同煮制时间和蒸制时间的制川乌片中5-HMF的含量进行检测，分析其含量随煮制和蒸制时间的变化规律，为川乌饮片的质量控制提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent1100高效液相色谱仪(DAD检测器、自动进样器、在线脱气机、四元泵，Agilent公司)；Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)； BS210S型电子天平(德国Sartorius公司，Max 210 g，d=0.1 mg)；超声波清洗器(SB22-12DTDN型，宁波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 试药

川乌片(购于四川江油中坝附子科技发展有限公司，经中国食品药品检定研究院张继主任药师鉴定为毛茛科植物乌头(AconitumcarmichaeliiDebx.)的母根)；5-羟甲基糠醛(批号MUST-15051212，成都赛思特生物科技有限公司，纯度>98%)；甲醇(色谱纯，美国Fisher公司)；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 炮制品的制备

生川乌片:取生川乌片，净制，备用。

煮制川乌片：参照2015版《中国药典》制川乌项下煮法炮制。取生川乌片，用水浸泡约5 h达内无干心，取出，加宽水分别沸水煮40 min、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h，取出，干燥。

蒸制川乌片：参照2015版《中国药典》制川乌项下蒸法炮制。取生川乌片，用水浸泡约5 h达内无干心，取出加水分别蒸1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h，取出，干燥。

观察上述炮制品的外观性状，均达到内无白心的质量要求，但麻舌感程度不同，结果见表2。以上样品分别粉碎，过3号筛，备用。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取对照品适量于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容，即得含5-羟甲基糠醛662 μg/mL的对照品母液。精密吸取一定量母液，加甲醇定容配制成浓度为0.066 2，0.662，1.986，3.31，4.634，5.985，7.282 μg/mL的系列对照品溶液，备用。

2.3 供试品溶液的制备

分别精密称取各炮制品粉末约1 g，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入体积分数80%甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声提取20 min，放冷，再称定重量，用体积分数80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液适量，微孔滤膜(0.45 μm)滤过，即得。

2.4 色谱条件

Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；甲醇为流动相A，以0.1%甲酸溶液为流动相B。洗脱梯度：0～5 min，5%A；5～20 min，5%～20%A；20～21 min，20%～80%A；21～35 min，20%A。检测波长284 nm；柱温25℃，流速1.0 mL/min；进样量10 μL。

2.5 标准曲线的绘制

精密吸取5-HMF的系列浓度对照品溶液各10 μL，进样测定，以峰面积y对浓度x进行线性回归。线性回归方程为：y=74.906x+15.667(R2=0.999 6，n=7)，5-羟甲基糠醛在0.066 2～7.282 μg/mL范围内线性关系良好。标准曲线见图1。

图1 5-羟甲基糠醛标准曲线

2.6 精密度试验

精密吸取浓度为2.648 μg/mL的 5-HMF对照品溶液，连续6次进样10 μl，依法测定峰面积，测得5-HMF峰面积的RSD为0.74%(n=6)，表明该方法精密度良好。

2.7 重复性试验

精密称取已知含量为48.78 μg/g的制川乌粉末1 g，平行共6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，依法测定，测得5-HMF峰面积的RSD为1.90%(n=6)。结果表明，该方法的重复性良好。

2.8 稳定性试验

取已知含量为48.78 μg/g的制川乌粉末1 g，按“2.3”项下制备供试品溶液，在制备后0，2，4，8，12 h分别进样10 μL，测定峰面积，计算得到5-HMF的RSD为1.58%。结果表明，供试品溶液在12 h 内稳定性良好。

2.9 加样回收率试验

称取已知含量为48.78 μg/g的制川乌粉末0.5 g，精密称定，平行共6份， 加入一定量的5-HMF对照品溶液，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件进行测定，计算5-羟甲基糠醛的平均回收率为98.58%，RSD为1.90%(n=6)，结果见表1。

表1 5-HMF加样回收率试验结果(n=6)

2.10 样品的含量测定

将川乌的各炮制品按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，每批次样品平行操作2份，按“2.4”项下色谱条件依法测定，计算生川乌片及不同炮制时间的制川乌片中5-HMF含量。结果见表2，色谱图见图2，5-HMF含量随煮制时间变化见图3。

表2 川乌各样品中5-HMF的含量(n=2)

图2 5-HMF对照品、生川乌片、不同煮制、蒸制时间的制川乌片HPLC图

图3 5-HMF含量随炮制时间的变化规律

3 讨论

传统直接以生川乌为原料浸泡达到同等程度约36 h[2]，本文采用生川乌片制备制川乌，其中浸泡至“内无干心”的时间约5 h；川乌产地切片虽使其成分有流失，但在制备制川乌过程中可大幅度缩短浸泡时间，节约工时，并在一定程度上减少成分流失。

本文建立了川乌中5-HMF的HPLC含量测定方法，该方法操作简单，结果稳定可靠，可作为制川乌饮片的质量控制的检测方法。

5-HMF是炮制过程中糖类美拉德反应产生的中间产物。结果表明，生川乌片炮制前后5-HMF的含量变化明显，且含量高低与炮制时间和加热方式有关。在6 h内，蒸或煮川乌片中的5-HMF的含量变化规律基本一致，均随着炮制时间的延长而呈非线性增加。加热1 h时，蒸或煮制川乌片中含量约为生品的5～6.3倍；加热在2～4 h之间，含量波动很小，煮制品的含量约为生品的10.9～11.7倍，蒸制品的含量约为生品的15.6～17.5倍；5～6 h，煮制品5-HMF含量急剧增加，约为生品的12.1～20.1倍；蒸制品含量则在4～5 h急剧增加，约为生品的34.4～41.3倍。同时，蒸制及煮制川乌片的颜色亦随着炮制时间的延长而加深，麻舌感逐渐减弱或消失。当制川乌片的外观颜色基本一致时，同一加热方式下的炮制品中的5-HMF含量也基本一致。此外，蒸制6 h之后，5-HMF含量呈波动变化，但无麻舌感，饮片片型皱缩，饮片颜色呈黑褐色，传统性状不符合《中国药典》要求。比较相同加热时间下的蒸制川乌和煮制川乌，结果发现蒸制川乌片中5-HMF的含量均明显高于煮制川乌片，可能与5-HMF易溶于水[3]，在煮制过程中大量流失在水煮液中有关。该研究结果可为制川乌片的炮制工艺及质量评价指标的选择和质量标准的制定提供借鉴。

体内外药理实验结果显示，5-HMF对CCl4急性肝损伤组织有保护作用；亦对由H2O2和葡萄糖所致血管内皮细胞损伤后的细胞均具有保护作用[4]。同时，5-HMF具有抗氧化、抗心肌缺血等对人体有益的作用[5-6]，但亦有研究表明5-HMF对人体横纹肌和内脏有毒副作用[7]。因此，炮制过程中5-HMF的含量变化对制川乌的质量评价具有一定意义，但尚须进一步研究，结合其药理、毒理作用及其对制川乌的外观性状、生物碱含量的影响等进行综合评价，以保障制川乌的安全性、有效性。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京:中国医药科技出版社，2015:39-40.

[2] 秦语欣,谭鹏,国伟,等.药典法制川乌的成品质量与炮制过程控制的关系[J].中华中医药杂志,2015,30(7):2548-2550.

[3] 吴立军.天然药物化学[M].4版.北京:人民卫生出版社,2004:73-74.

[4] 丁霞,王明艳,余宗亮,等.山茱萸中5-羟甲基糠醛的分离鉴定及生物活性研究[J].中国中药杂志,2008,33(4):392-396.

[5] 夏云,李志明,朱丹妮,等.化学生脉散复方化学动态变化与药效关系的研究生脉散复方化学的研究(Vi )[J].中国中药杂志,1998,23(4):230-231.

[6] 许腊英,余鹏,毛维伦,等.中药乌梅的研究进展[J].湖北中医学院学报,2003,5(1):52-57.

[7] Surh Y,Tannenbaum SR.Activation of the Maillard reaction product 5-Hydroxymethyl furfural to strong mutagens via allylic sulfonation and chlorination[J].Chem Res Toxicol,1994,7(3):313-318.

Changes of 5-hydroxymethylfurfuraldehyde Content in Radix Aconiti Tablets Processed at Different Time Points

WANG Lei1,ZHANG Yu-fan1,WANG Xin1,PENG Shi-tao1,YUAN Jin-feng1,

ZHANG Xian-ling1,CHEN Jiong2,LI Fei1*

(1.Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China; 2. Hebei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shijiazhuang 050011, China)

Objective: To find the changing regularity of 5-Hydroxymethylfurfuraldehyde (5-HMF) content in Radix Aconiti tablets processed at different time points.Methods: HPLC was used to determine the changes of 5-HMF content in different processed products of Radix Aconiti.Results: The content of 5-HMF of the raw product was 4.45 μg/g. The content of 5-HMF was increased within the first six hours of heating. At the same processing time, the content of steamed products was significantly higher than that of boiled products. Conclusion: An HPLC method for determining the content of 5-HMF has been established. The proposed method is stable and reliable. The changes of the content of 5-HMF of Radix Aconiti tablets are processed by steaming and boiling for two kinds, which were associated with the heating time. It provides a reference for the quality control of Radix Aconiti.

Radix Aconiti tablets; Processing; HPLC; 5-hydroxymethylfurfural

国家中医药行业科研专项资助项目(No.201107008)；科技部科技基础性工作专项资助项目(No.2014FY111100-3)

王蕾(1992-)，女，北京中医药大学2014级在读硕士研究生，主要研究方向：中药炮制。

李飞*(1963-)，女，教授，硕士研究生导师，主要研究方向：中药炮制工艺、原理及其质量标准的研究。

2016-10-25

R285.5

A

1002-2406(2017)03-0017-03

修回日期：2016-11-01