外周细胞淋巴瘤中TET2和DNMT3A的表达及意义

孙孟琦，王丽丽，冉雯雯，李 宏，邢晓明

外周细胞淋巴瘤中TET2和DNMT3A的表达及意义

孙孟琦1，王丽丽2，冉雯雯2，李 宏2，邢晓明2

目的 探讨TET2和DNMT3A在外周T细胞淋巴瘤(peripheral T-cell lymphoma, PTCL)中的表达及其与PTCL免疫表型的关系。方法 应用CD3、CD4、CD10、BCL-6、CXCL-13、CD30、ALK免疫标记将PTCL分为血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(angioimmu-noblastic Tcelll ymphoma, AITL)、外周T细胞淋巴瘤，非特指(peripheral T-cell lymphoma, not otherwise specified, PTCL-NOS)、ALK阳性的间变性大细胞淋巴瘤(ALK+ anaplastic large cell lymphoma, ALK+ALCL)和ALK阴性的间变性大细胞淋巴瘤(ALK- anaplastic large cell lymphoma, ALK-ALCL)4种类型。应用免疫组化法检测PTCL组织中TET2和DNMT3A的表达。结果 89例PTCL中，AITL 36例，PTCL-NOS 26例，ALK-ALCL 18例，ALK+ALCL 9例。在AITL组织中，TET2胞质表达和DNMT3A胞质及胞核表达的高表达率均高于PTCL-NOS和ALCL，差异有统计学意义(P均<0.05)。TET2胞质表达和DNMT3A胞质及胞核表达在AITL中均呈正相关(P<0.05)。结论 TET2和DNMT3A可以作为诊断AITL的分子标志物，为AITL的明确诊断提供新策略。

淋巴瘤；外周T细胞淋巴瘤；TET2；DNMT3A；免疫组织化学

外周T细胞淋巴瘤(peripheral T-cell lymphoma, PTCL)是一组具有高度异质性的淋巴组织恶性增殖性病变，起源于胸腺后成熟T细胞或自然杀伤细胞，占非霍奇金淋巴瘤的10%～15%，其侵袭性强，预后差，5年生存率约30%，目前尚无有效的治疗方案。由于对PTCL的分子机制知之甚少以及缺乏有效的分子标志物，导致PTCL分类复杂。根据(2008)WHO淋巴造血组织疾病分类，最常见的PTCL亚型包括外周T细胞淋巴瘤，非特指(peripheral T-cell lymphoma, not otherwise specified, PTCL-NOS)、血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤(angioimmunoblastic T cell lymphoma, AITL)、ALK阴性的间变性大细胞淋巴瘤(ALK- anaplastic large cell lymphoma, ALK-ALCL)和ALK阳性的间变性大细胞淋巴瘤(ALK+ anaplastic large cell lymphoma, ALK+ALCL)。

随着基因测序水平的不断提高，有关表观遗传调控的基因，如TET2和DNMT3A等突变在血液系统恶性肿瘤中相继被发现[1-2]。随后，TET2和DNMT3A突变被发现存在于淋巴瘤中，且在T细胞淋巴瘤中两者突变有一定的相关性[3-4]。但对TET2及DNMT3A在PTCL中蛋白表达的研究较少，本文将从蛋白水平探讨TET2与DNMT3A蛋白表达水平改变及其与PTCL各亚型之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 收集青岛大学附属医院2008年11月～2016年4月诊治的淋巴瘤患者，筛选病理诊断为PTCL病例，剔除重复送检、穿刺组织及未明确病理分型病例，共89例。

1.2 免疫组化 标本均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，3 μm厚切片。免疫组化染色采用PV6000法。所用抗体TET2(ab94580)、DNMT3A(ab23565)购于Abcam公司，TET2抗体浓度1 ∶300，DNMT3A抗体浓度1 ∶800，CD3、CD4、CD10、BCL-6、CXCL-13、CD30、ALK工作液抗体均购于北京中杉金桥公司，血管壁(TET2)和大鼠肺(DNMT3A)为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。应用EDTA 9.0修复液，高压修复2 min。

将TET2、DNMT3A表达情况采用半定量评估：随机选取5个高倍视野计数阳性细胞数。(1)按阳性细胞率计分：阳性细胞数占0～5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，76%～100%为4分；(2)按着色强度计分：无阳性着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；将两项得分结果相加：0～3分为低表达，4分及以上为高表达[5]。由于TET2胞核表达及DNMT3A胞质高表达例数较少，所以将评分标准改为0～2分为低表达，3分及以上为高表达。

1.3 统计学分析 采用SPSS 21.0软件进行数据分析，各组间数据比较采用χ2检验，两因素间的相关性采用非参数Spearman等级相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PTCL亚型 89例PTCL中36例AITL、26例PTCL-NOS、9例ALK+ALCL、18例ALK-ALCL。

2.2 TET2和DNMT3A在PTCL中的表达 TET2、DNMT3A均表达于胞质或胞核，其中TET2胞质高表达50例，胞核高表达19例(图1)；DNMT3A胞质高表达19例，胞核高表达48例(图2)。

2.3 TET2、DNMT3A表达与PTCL临床病理特征的关系 TET2在临床Ⅲ+Ⅳ期PTCL的胞质高表达率(67.4%)高于Ⅰ+Ⅱ期(40%)，差异虽无统计学意义，但处于临界水平(P=0.061)。在有B症状的PTCL患者中，TET2胞核高表达率(45%)高于无B症状者(8.11%，P=0.003)。TET2表达部位与PTCL患者性别、年龄、LDH水平、IPI评分、结外浸润无关(P>0.05)，DNMT3A表达部位与PTCL患者性别、年龄、LDH水平、临床分期、IPI评分、B症状、结外浸润均无关(P>0.05，表1)。

2.4 TET2和DNMT3A在PTCL各亚型中的表达 在胞质表达中，TET2在AITL中高表达率(83.3%)均高于PTCL-NOS(42.3%)和ALCL(33.3%)，差异有统计学意义(P<0.05，表2)，PTCL-NOS与ALCL的高表达率差异无统计学意义(P>0.05)；DNMT3A高表达率在AITL、PTCL-NOS、ALCL中分别为16.7%、11.5%、14.8%，同样AITL与PTCL-NOS、ALCL高表达率之间的差异有统计学意义(P<0.05)。在胞核表达中，TET2的高表达率在各亚型中之间无差异(P>0.05)，DNMT3A高表达率在各亚型之间均有差异，表达率高低依次为AITL、PTCL-NOS、ALCL(77.8%、53.8%、22.2%，P均<0.05，表3)。ALK+ALCL和ALK-ALCL之间TET2、DNMT3A表达差异均无统计学意义(P>0.05，表4)。

2.5 TET2表达与DNMT3A表达的相关性分析 在89例PTCL中，TET2胞质表达与DNMT3A表达(胞质与胞核)呈正相关。在AITL中，TET2胞质表达与DNTM3A表达呈正相关关系，在PTCL-NOS及ALCL中两者表达无相关性(表5)。TET2胞核表达与DNMT3A(胞质与胞核)表达均无相关性(P>0.05)。

表1 TET2、DNMT3A表达与外周T细胞淋巴瘤临床病理特征的关系

①A①B①C②A②B②C

图1 外周T细胞淋巴瘤中TET2的表达：A.胞质阳性；B.胞核阳性；C.阴性，PV6000法 图2 外周T细胞淋巴瘤中DNMT3A的表达：A.胞质阳性；B.胞核阳性；C.阴性，PV6000法

表2 TET2、DNMT3A胞质表达在外周T细胞淋巴瘤各亚型中表达的比较

表3 TET2、DNMT3A胞核表达在外周T细胞淋巴瘤各亚型中表达的比较

表4 TET2、DNMT3A在ALK阳性与ALK阴性间变性大细胞淋巴瘤中表达的比较

3 讨论

表观遗传学(epigenetics)是指在DNA的核苷酸序列不变前提下引起基因表达或细胞表型变化的遗传机制，主要包括DNA的胞嘧啶(C)甲基化，组蛋白修饰和染色体重塑等。DNA的胞嘧啶甲基化在基因组印迹、基因表达调节、X染色体失活、癌症发生等方面发挥重要作用。TET2、DNMT3A等基因主要参与DNA甲基化的调节。

近年来，TET2在肿瘤发生、发展中的作用成为研究热点。TET2基因属于TET基因家族，定位于染色体4q24。TET2蛋白具有α-KG和Fe2+依赖的双加氧酶活性，可将5-甲基胞嘧啶(5-mC)转化为5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)，5-hmC被认为是DNA主动去甲基化的重要中间产物，TET2通过将5mC转化为5-hmC来参与DNA去甲基化，进而下调DNA甲基化水平，因此TET2是DNA去甲基化过程中的关键酶[6-7]。

TET2为抑癌基因，失活突变TET2突变导致许多血液系统疾病患者体内的TET2蛋白功能降低或丢失[1]。Ko等[8]发现，TET2突变主要通过影响TET2蛋白活性而引起髓系恶性肿瘤。有研究发现淋巴瘤也存在TET2突变，且TET2在AITL中的突变率最常见，其次为PTCL-NOS[9-11]，但TET2蛋白在淋巴瘤中的表达情况却少有研究。本组实验中，AITL中TET2蛋白胞质表达明显高于PTCL-NOS与ALCL，说明在PTCL中TET2基因突变后可能并未影响TET2蛋白的表达而是影响了蛋白的活性。或者存在其他基因突变，如IDH1/2[12]，导致TET2功能缺失或异常。本实验发现在各亚型之间TET2蛋白胞核表达的高表达率均无差异，所以关于TET2基因突变是否改变TET2蛋白表达部位以及TET2蛋白不同表达部位与PTCL的关系尚待进一步研究明确。胞质表达的TET2蛋白在AITL中阳性率均高于PTCL-NOS和ALCL，提示TET2蛋白有作为AITL诊断标志物的可能性。Delhommeau等[1]还发现TET2基因突变存在于CD34+的造血干细胞或造血祖细胞，说明在疾病发生早期即存在TET2突变。Quivoron等[3]研究发现在淋巴瘤发生的早期和晚期阶段均存在TET2突变，说明TET2突变可能与淋巴瘤的发生、发展有关。Muto等[13]研究发现TET2基因的敲除导致小鼠有Tfh特征的T细胞淋巴瘤的发生，说明TET2突变对人类有Tfh特征的T细胞淋巴瘤的发生可能有重要作用，进一步说明TET2可有助于AITL的明确诊断。Yang等[14]发现，TET2在乳腺癌等某些上皮来源性肿瘤中的表达都较正常组织降低，进而认为TET2基因在上述肿瘤中表达降低，但Yang等并未直接检测TET2蛋白的表达，所以对于TET2基因突变对TET2蛋白的影响还有待进一步研究。

DNMT3A属于DNMT家族，位于染色体2p23。DNMT3A编码一个甲基化转移酶，将CpG岛的胞嘧啶转化为甲基化胞嘧啶，进而参与DNA从头甲基化过程。目前对DNMT3A突变后对其基因表达、蛋白表达及功能及DNA甲基化水平的改变没有一致结果。Ley等[2]研究表明在发生DNMT3A突变和未突变的细胞中DNMT3A基因、蛋白表达水平和5-mC水平没有明显不同，而且DNMT3A突变并不直接影响其酶活性。但也有学者为DNMT3A突变使DNMT3A酶活性降低[15]。有研究发现，DNMT3A在AITL中最常见，突变率为33%～38.%[9, 11]。在本组实验中，AITL中DNMT3A胞质及胞核表达均较高，说明DNMT3A突变后可能不会影响其蛋白的表达，可能会影响DNMT3A蛋白的功能，或者存在其他基因突变抑制DNMT3A蛋白的作用。本组实验发现，无论胞质还是胞核，AITL患者DNMT3A高表达率均明显高于PTCL-NOS和ALCL，说明DNMT3A也具有作为AITL的诊断标志物的可能性。

Couronne等[4]研究发现，DNMT3A在PTCL中存在突变，突变率为11%，且DNMT3A突变的患者中有73%同时伴有TET2突变，他们认为TET2和DNMT3A突变可能使胞嘧啶的甲基化和去甲基化过程失调。Odejide等[9]发现，DNMT3A在AITL中的突变率为33%，且同时都有TET2突变，这说明TET2与DNMT3A在参与DNA甲基化调控过程中可能具有协同作用，且DNMT3A催化的启动子区域的甲基化与TET2催化的主动去甲基化可能为一动态平衡过程。在本研究中，我们发现胞质表达的TET2与DNMT3A在PTCL中表达呈正相关，进一步分析发现在AITL中TET2胞质表达与胞质及胞核表达的DNMT3A均呈正相关，说明TET2与DNMT3A在参与DNA甲基化调控过程中可能具有协同作用，也提示TET2与DNMT3A蛋白可联合作为诊断AITL分子标志物的可能性。但胞核表达的TET2与DNMT3A表达无相关关系，所以关于TET2蛋白表达部位不同与PTCL发生、发展的关系以及与PTCL甲基化调节的关系尚待进一步研究明确。

总之，本组实验发现TET2胞质表达和DNMT3A表达在AITL中的高表达率均高于PTCL-NOS和ALCL，且两者表达呈正相关，为AITL的明确诊断提供新策略。实验还发现TET2在临床Ⅲ+Ⅳ期PTCL的胞质高表达率高于Ⅰ+Ⅱ期，有B症状的PTCL患者TET2胞核高表达率高于无B症状者，为PTCL患者的治疗提供了新线索。在本组实验中，TET2胞核表达在PTCL各亚型中差异不明显，关于TET2在PTCL中表达部位的差异仍需进一步实验说明。TET2与DNMT3A突变后导致甲基化紊乱的机制，TET2、DNMT3A基因表达及其蛋白作用的调控机制还有待进一步研究。

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Expression of TET2 and DNMT3A in peripheral T cell lymphoma and their significance

SUN Meng-qi1, WANG Li-li2, RAN Wen-wen2, LI Hong2, XING Xiao-ming2
(1DepartmentofPathology,BasicMedicalCollegeofQingdaoUniversity,Qingdao266071,China;2DepartmentofPathology,theAffiliatedHospitalofQingdaoUniversity,Qingdao266003,China)

Purpose To investigate the expression of TET2 and DNMT3A in patients with peripheral T cell lymphoma (PTCL) and the relationship to immunophenotypes of PTCL. Methods Using a panel of immunohistochemical markers (CD3, CD4, CD10, BCL-6, CXCL-13, CD30, ALK), all cases of PTCLs were further divided into four groups, including angioimmunoblastic T cell lymphoma (AITL), peripheral T cell lymphoma, not otherwise specified (PTCL-NOS), anaplastic lymphoma kinase negative anaplastic large cell lymphoma (ALK-ALCL) and anaplastic lymphoma kinase positive anaplastic large cell lymphoma (ALK+ALCL). The expression of TET2 and DNMT3A in 89 cases of PTCL was detected by immunohistochemical analysis. Results 89 cases were divide into four subtypes, AITL (36/89), PTCL-NOS (26/89), ALK-ALCL (18/89), and ALK+ALCL (9/89). Immunohistochemistry staining revealed higher cytoplasmic expression of TET2 and DNMT3A in AITL than that of in PTCL-NOS and ALCL (P<0.05). And the nuclear expression of DNMT3A in patients with AITL was higher than that of PTCL-NOS and ALCL (P<0.05). The cytoplasmic expression of TET2 was positively related with both cytoplasmic and nuclear expression of DNMT3A in patients with AITL (P<0.05). Conclusion TET2 combined with DNMT3A could be used as markers in AITL diagnosis, which could provide new strategy for AITL diagnosis.

lymphoma; peripheral T cell lymphoma; TET2; DNMT3A; immunohistochemistry

1青岛大学基础医学院病理学教研室，青岛 2660712青岛大学附属医院病理科，青岛 266003

孙孟琦，女，硕士研究生。E-mail: sunmq1103@163.com 邢晓明，女，副教授，硕士生导师，通讯作者。Tel: (0532)82911533，E-mail: edithxing@hotmail.com

时间：2017-4-17 18:19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170417.1819.008.html

R 733.4

A

1001-7399(2017)04-0388-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.04.008

接受日期：2017-02-16