白术多糖对嗜水气单胞菌抑菌效果的影响

樊敏欢梁日深

(1.广东科贸职业学院人文外语系,广东广州 510430; 2.仲恺农业工程学院,广东广州 510225)

白术多糖对嗜水气单胞菌抑菌效果的影响

樊敏欢1梁日深2

(1.广东科贸职业学院人文外语系,广东广州 510430; 2.仲恺农业工程学院,广东广州 510225)

目前，由嗜水气单胞菌引起的水产动物的疾病防治多采用抗生素，但抗生素的滥用造成了耐药性的增强，给鱼病的治疗带来困难。而白术多糖相对于抗生素具有天然、无残留、毒副作用小、不产生耐药性等优点。本试验通过对白术多糖进行分离纯化，配制成不同浓度梯度的白术多糖溶液，研究其抑菌最小有效浓度。为白术多糖在水产健康养殖的开发和利用上提供依据。

白术多糖 嗜水气单胞菌 杂交鳢鱼 药代动力学 有效浓度

1 前言

杂交鳢容易因感染嗜水气单胞菌而引发腐皮病。病鱼多呈现溃烂病症，体表溃烂、出血，出现烂身、烂尾现象，解剖可见肝脏等遭受损害。该病一年四季均可流行，病程较长且死亡率高。然而国内外目前对杂交鳢溃烂病病原的分析这方面还存在很大的空白。本实验从杂交鳢病鱼身上分离疑似菌株进行鉴定，并对其不同浓度中药白术多糖的敏感性等进行分析，旨在为杂交鳢养殖过程中的疾病防治提供参考。

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 试验样品

实验病鱼样品采自佛山市顺德区一养殖场所养殖的患病杂交鳢，病鱼体表部分溃烂，出血，腹部肿胀；解剖观察发现肝脏、肾脏红肿、部分糜烂、胆囊肿大，腹腔有血红腹水。

2.1.2 主要试剂及培养基

营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、细菌生理生化鉴定管、药敏试纸测试盒白术多糖溶液

2.2 实验方法

2.2.1 病鱼体表及内部病理学观察

佛山某养殖场部分杂交鳢体表出现烂身、烂尾、出血以及腹部肿胀等病理症状，剖开腹部可观察到病鱼肠道及肝脏等器官呈充血现象；病鱼大多精神沉郁，食欲不振，甚至死亡。

2.2.2 不同浓度白术多糖原液配制

准确称取80% 白术多糖12.5mg，溶于10ml胚胎水中，充分混匀，0.22μm过滤器过滤灭菌，配制成1mg/ml的白术多糖原液。然后稀释成不同浓度梯度溶液，分别为：10 μg/ml、50μg/ ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml、250μg/ml、300μg/ml、350μg/ml、400μg/ml、450μg/ml、500μg/ml、550μg/ml、600μg/ml、650μg/ml、700μg/ml、750μg/ml、800μg/ml、850μg/ml、900μg/ml、950μg/ml、1mg/ml等21个浓度梯度。

2.2.3 疑似菌株的分离培养

（1）分离菌株：

从患有溃烂病的杂交鳢病灶中分离出疑似菌株，在超净工作台无菌操作条件下，从病鱼肝脏、肾脏、脾脏3个部位取样，在酒精灯旁边用灭菌剪刀剪开器官组织，灼烧灭菌的接种环伸入病料中蘸上少量病料，于固体平板中进行3区划线，平板倒置，于37℃恒温培养箱中培养过夜（16～18h）。

（2）菌液分离培养：

在无菌操作条件下，挑取平板生长良好的单菌落接种于LB液体培养基中，轻微摇晃混匀，于37℃恒温振荡培养箱中振荡培养过夜（16～18h），用于后续实验。

2.2.4 生理生化鉴定

采用细菌生理生化鉴定管对待测菌株进行生理生化鉴定，将纯化好的细菌分别进行以下几项生理生化反应实验：糖发酵实验（葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇）甲基红实验、VP实验、靛基质实验、脲酶实验、枸橼酸盐实验、硫化氢实验、甘露醇、山梨醇、氨基酸脱羧酶反应（赖氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸），具体操作过程按相应的生化反应管操作步骤进行。

2.2.5 药敏试验

采用纸片琼脂扩散（K-B）法[8]对待测菌株进行药敏实验检测，测定其对不同浓度白术多糖溶液的敏感性，具体操作如下：

细菌涂布接种：在无菌操作条件下，吸取150μl菌液于固体培养平板中，利用涂布棒将平板上的菌液涂抹均匀，涂布完毕，室温下置3～5min待琼脂表面的菌液充分吸收。涂布棒在使用前和使用后都要燃烧灭菌。

贴药敏纸片：用无菌镊子夹取药物纸片平贴在种好细菌的琼脂表面，每个平板贴3种药物纸片。

培养：贴好药物纸片的平板应于室温下放置15min，然后翻转平板，放37℃培养18～24h之后观察结果。

结果记录：用直尺从背面精确测量包括纸片直径在内的抑菌环直径，测得结果以毫米为单位进行记录。

3 结果与分析

3.1 致病菌的形态观察

分离菌株在普通营养琼脂中生长良好，菌落边缘整齐、光滑，微隆起，半透明，颜色乳白色或淡黄色，菌落大小与培养时间以及温度有关，最大可达4mm。

3.2 细菌生理生化鉴定结果

菌株生理生化鉴定结果如下表[11-13]，其中“+”表示反应阳性，“-”表示反应阴性。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》及相关研究资料，初步判断该菌株为嗜水气单胞菌。

表1 生理生化鉴定

3.3 药敏实验结果

药敏实验中经过37℃培养24h后，不同抗生素药敏纸片呈现出不同的抑菌效果，出现有或无，大小不定的抑菌圈，部分药敏实验结果如下图。测量各药敏纸片抑菌环直径大小，其中18mm以上为高度敏感，13～18mm为中度敏感，13 mm以下为耐药。

表2 药敏实验

4 讨论

本研究中的药敏实验结果可为杂交鳢溃烂病防治用药提供参考。结果可见杂交鳢体内嗜水气单胞菌对不同浓度梯度白术多糖的敏感性。在22个不同梯度的溶液中，嗜水气单胞菌对1m/ml、950μg/ml、900μg/ml、850μg/ml、800μg/ml、750μg/ ml、700μg/ml、650μg/ml浓度白术多糖表现为高度敏感，对0μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ ml、250μg/ml、300μg/ml等浓度白术多糖表现为耐药。其中对450μg/ml浓度白术多糖表现出耐药性可能由于实验操作过程中试纸污染的情况导致的。由此试验可得，白术多糖对嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度为：350μg/ml。

[1] 陈霞.鲤鱼腹水症的病源学与病理学研究[D].四川农业大学，2006.

[2] 刘明智.嗜水气单胞菌鉴定、重组外膜蛋白W的制备及免疫原性研究[D].上海海洋大学，2010.