HPLC标准曲线法测定酵母中谷胱甘肽

杜梨梨，罗必英

（安琪酵母股份有限公司检测中心，湖北宜昌443005）

HPLC标准曲线法测定酵母中谷胱甘肽

杜梨梨，罗必英

（安琪酵母股份有限公司检测中心，湖北宜昌443005）

通过HPLC标准曲线法进行酵母中还原型和氧化型谷胱甘肽含量测定的研究，利用Intersil ODS-3 C18柱，以庚烷磺酸钠-磷酸盐缓冲溶液（pH3.0）和甲醇（v∶v=90∶10）为流动相，流速为1.0 mL/min，检测波长为210nm，得到氧化型和还原型谷胱甘肽的相关系数均为0.9999，检测限分别为2.40mg/L、2.27mg/L，定量限分别为9.0 mg/L、8.5 mg/L，精密度分别为2.00%、0.94%，回收率分别为100.12%～103.43%和95.23%～96.44%之间。

谷胱甘肽； 氧化型； 还原型； HPLC； 酵母

谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合而成的含有巯基的三肽，有还原型和氧化型两种形式[1]。它广泛存在于所有的生物细胞中，以酵母[2]、小麦胚芽以及人和动物肝脏、肾等含量最为丰富。谷胱甘肽具有整合解毒作用，能帮助人体保持正常的免疫系统功能。它可以用于药物，也可以作为功能性食品的有效成分，在延缓衰老、增强免疫力、抗肿瘤等功能性食品中广泛应用。

酵母中谷胱甘肽的检测方法较多，有比色法、荧光法、碘量法和高效液相色谱法（HPLC）等[2-5]。本实验采用沸水浴提取酵母中的谷胱甘肽，用高效液相色谱法检测其含量，该方法对完善和改进谷胱甘肽的检测方法有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

耗材及试剂：还原型谷胱甘肽标准品：沃凯，国药集团化学试剂有限公司，CAS：70-18-8；氧化型谷胱甘肽标准品：Sigma-Aldrich，CAS：27025-41-8；庚烷磺酸钠，磷酸二氢钾，磷酸，盐酸。

仪器设备：Agilent1200高效液相色谱仪；电热恒温水浴锅；色谱柱：Intersil ODS-3 C18，250 mm× 4.6 mm，5μm。

1.2 实验方法

1.2.1 酵母细胞中谷胱甘肽的提取

称取样品0.5 g，加0.01 mol/L盐酸40 mL，100℃水浴加热，并不停搅拌，5 min后迅速置于冰浴中冷却至室温，用0.01 mol/L盐酸定容至50 mL。摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤后待测。

1.2.2 谷胱甘肽的HPLC分析条件

流动相：A∶B=90∶10（v∶v）。

A相（庚烷磺酸钠-磷酸盐缓冲溶液）：称取磷酸二氢钾3.4 g，庚烷磺酸钠1.1 g，溶于500 mL水中，用磷酸调节pH值至3.0，0.45μm微孔滤膜过滤。

B相：甲醇。

检测波长，210 nm；流速，1.0 mL/min；进样量，20μL；柱温，35℃。

1.2.3 谷胱甘肽标准曲线的绘制

配制浓度分别为8μg/mL、20μg/mL、35μg/mL、70μg/mL、140μg/mL的谷胱甘肽系列标准溶液，依上述分析条件进样分析，制作氧化型和还原型谷胱甘肽标准品工作曲线。

1.2.4 HPLC测定酵母细胞中谷胱甘肽的含量

取1.2.1中待测液进样分析，色谱条件如上所述。依据1.2.3中谷胱甘肽标准系列工作曲线计算样品中氧化型和还原型谷胱甘肽的含量。

2 结果与分析

2.1 检测波长的选择

取一定浓度的还原型和氧化型谷胱甘肽进行检测，两者的光谱图见图1、图2。由图1、图2可知，氧化型与还原型谷胱甘肽的最大吸收波长在190～195 nm之间，由于仪器在此波长时不够稳定，故检测波长选择210 nm。

2.2 流动相（庚烷磺酸钠-磷酸盐缓冲溶液）pH值的选择

流动相pH值会影响样品的出峰时间。选择3个不同pH值的庚烷磺酸钠-磷酸盐缓冲溶液进行实验，还原型和氧化型谷胱甘肽的出峰时间见表1。由于pH2.5时标样出峰时间较长，且不利于保护色谱柱，故选择庚烷磺酸钠-磷酸盐缓冲溶液的pH3.0。

2.3 流动相比例的选择

图1 还原型谷胱甘肽光谱图

图2 氧化型谷胱甘肽光谱图

表1 不同pH值流动相对应谷胱甘肽出峰时间表

流动相成分不同，样品出峰时间不同。选择5个不同的流动相比例进行实验，还原型和氧化型谷胱甘肽的出峰时间见表2。依据出峰时间选择A相与B相比例为90∶10，氧化型和还原型谷胱甘肽的图谱见图3。

表2 不同流动相比例对应谷胱甘肽出峰时间表

2.4 样品处理方法考察

酵母中谷胱甘肽的提取受盐酸浓度、水浴锅温度以及提取时间3个因素的影响。本实验对每个因素进行3个水平的考察。温度选择80℃、100℃、121℃，盐酸浓度选择0.005 mol/L、0.01 mol/L、0.02 mol/L，处理时间选择5 min、10 min、15 min进行正交实验，实验结果见表3。

由表3可知，温度的影响最大，其中100℃时提取效果最好。盐酸浓度为0.005 mol/L和0.01 mol/L时差别不大，提取结果均高于0.02 mol/L，此时选择0.01 mol/L。处理时间不同，提取效果也不同，依次是5 min的提取效果＞15 min的提取效果＞10 min的提取效果。

针对正交实验的结果，进行正交实验补充实验。对某一样品，处理条件为温度100℃、盐酸浓度0.01 mol/L，时间选择3 min、4 min、5 min、6 min、7 min、10 min和15 min。实验结果见图4。

图3 流动相比例为90:10时氧化型和还原型谷胱甘肽图谱

图4 不同样品处理时间对应的谷胱甘肽含量

由图4可知，当处理时间为5 min时，还原型和氧化型谷胱甘肽的提取效果都比较好，因此样品处理时间选择5 min，样品图谱见图5。

图5 样品处理时间为5 min时对应的色谱图

表3 3因子3水平正交实验结果表

表4 HPLC标准曲线法检测氧化型和还原型谷胱甘肽结果

2.5 线性范围考察

配制浓度在1～200 mg/L范围内的一系列混标进行HPLC分析。结果表明，当谷胱甘肽的浓度达到145 mg/L以上时，氧化型和还原型谷胱甘肽的峰形不对称，说明最大浓度应小于145 mg/L。当氧化型、还原型谷胱甘肽浓度分别为2.40 mg/L、2.27 mg/L时，检测限约为3倍的噪声水平。当氧化型、还原型谷胱甘肽浓度分别为9.0 mg/L、8.5 mg/L时，检测限约为10倍的噪声水平，此浓度为仪器的定量限。

2.6 精密度考察

称取同一样品6份，进行平行测定。由表4可知，氧化型和还原型谷胱甘肽的相对标准偏差分别为2.00%、0.94%。

2.7 回收率考察

根据精密度测定的结果，可知样品含量。以上同一个样取9份，分别添加约80%、100%、120%进行回收率测定。测定数据见表4，氧化型和还原型谷胱甘肽的加标回收率在95.23%～103.43%之间。

3 结论

本实验建立了一种快速、准确测定谷胱甘肽的高效液相色谱方法。利用Intersil ODS-3 C18柱，以庚烷磺酸钠-磷酸盐缓冲溶液（pH3.0）和甲醇（v∶v= 90∶10）为流动相，流速为1.0 mL/min，检测波长为210 nm，在10 min内成功分离和定量分析了还原型和氧化型谷胱甘肽。该方法下，氧化型和还原型谷胱甘肽的相关系数均为0.9999，检测限分别为2.40 mg/L、2.27 mg/L，定量限分别为9.0 mg/L、8.5 mg/L，精密度分别为2.00%、0.94%，回收率分别为100.12%～103.43%、95.23%～96.44%。

[1] 贾贞,王丹,游松.谷胱甘肽的研究进展[J].沈阳药科大学学报,2009,26(3)：238-241.

[2] 范崇东,王淼,徐榕榕.热水提取酵母中谷胱甘肽的条件优化[J].食品工业科技,2004(2)：127-129.

[3] 杜小莉,朱珠,傅强,等.HPLC测定还原型谷胱甘肽的血浆浓度[J].中国药学杂志,2005(6)：64-67.

[4] 滕艳坤,阚微娜.HPLC法测定还原型谷胱甘肽片中杂质氧化型谷胱甘肽含量[J].中国药师,2014(2)：45-47.

[5] 陈芬,赵晓燕,饶钦雄,等.HPLC测定姬松茸中谷胱甘肽的含量[J].天然产物研究与开发,2014(9)：122-125.

Determination of Glutathione in Yeast by HPLC Standard Curve Method

DU Lili and LUO Biying
(Angel Yeast Co.Ltd.,Yichang,Hubei 443005,China)

The content of reduced/oxidized glutathione in yeast was measured by HPLC standard curve method.Intersil ODS-3 C18 column was applied,sodium heptane sulfonate-hydrogen phosphate buffer solution(pH=3)and methanol(v∶v=90∶10)was used as mobile phase,flowing rate was 1.0 mL/min,and detection wavelength was 210 nm.The correlation coefficient of reduced/oxidized glutathione was 0.9999,and their detection limits were 2.27 mg/L and 2.40 mg/L respectively,their quantification limits were 8.5 mg/L and 9.0 mg/L respectively,their precision were 0.94%and 2.00%respectively,and their recoveries were 95.23%to 96.44%and 100.12%to 103.43%respectively.(Trans.by YUE YANG)

glutathione;oxidized;reduced;HPLC;yeast

TS261.1；TS261.7；TQ926

A

1001-9286（2017）06-0119-04

10.13746/j.njkj.2017014

2017-01-22

杜梨梨（1983-），女，从事生物技术方面的专业研究。

优先数字出版时间：2017-04-17；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170417.1056.008.html。