鱼肉样品中的手性多氯联苯对映体的分离测定研究

朱 帅，饶 竹

(国家地质实验测试中心，北京 100037)



鱼肉样品中的手性多氯联苯对映体的分离测定研究

朱 帅*，饶 竹

(国家地质实验测试中心，北京 100037)

该文建立了鱼肉样品中7种手性多氯联苯(PCB 45，PCB 91，PCB 95，PCB132，PCB 136，PCB 149和PCB 174)对映体的分离测定方法。样品经快速溶剂萃取技术萃取后，浓缩液经过凝胶渗透色谱除脂及大分子物质后再依次通过酸性硅胶柱、复合硅胶柱净化和碱性氧化铝柱分离得到PCBs 组分。在气相色谱-质谱(GC-EI/MS)上对比研究了BateDex-325，CP-Chirasil，BGB-172SE，Chirasil-Dex和Cyclosil-B手性色谱柱的拆分效果，发现7种手性PCBs在Cyclosil-B毛细管柱上的分离效果最好，其分离度为0.8～2.3，可以实现基线分离。在优化色谱条件下，7种手性PCBs在10～200 μg·L-1浓度范围内线性良好，相关系数为0.998～1.000，方法检出限(S/N=3)为0.4～5.0 ng·g-1。在高、低2个加标水平下，7种手性PCBs的回收率为89.2%～114%，相对标准偏差为0.3%～2.1%，表明方法灵敏度高、回收率好、准确度高。采集广东电子垃圾拆解污染区鱼类样品验证方法的适用性，结果显示鱼肉样品中均检出7种手性PCBs，3种鱼肉样品中7种手性PCBs的总浓度为386.7～602.8 ng·g-1。对3种鱼肉组织中7种手性PCBs 的EF值进行测定，发现PCB 45，PCB 91，PCB 95，PCB 132，PCB 136和PCB 174的EF 值与标准品具有显著差异，表明这些手性PCBs 在鱼类体内可能具有对映体选择性富集和代谢作用，此外PCB 45，PCB 91，PCB 95，PCB 132和PCB 136在3种鱼肉组织中的分布特征相似，而PCB174的EF值在乌鳢体内大于标准品，而在鲮鱼、鲫鱼体内却小于标准品，表明PCB174在乌鳢和鲮鱼、鲫鱼体内的选择性代谢过程可能相反。

手性；多氯联苯；气相色谱-质谱;鱼肉；对映体分离

多氯联苯(PCBs)作为典型的持久性有机污染物具有化学性质稳定、脂溶性强和易在生物体中富集[1]等特性。此外，PCBs具有致癌性，可对免疫、生殖和神经系统造成危害，并可通过生物放大作用对高等动物，尤其是人类健康带来巨大的潜在风险[2]，从而引起世界各国的广泛关注。由于氯原子取代位置的差异，209 种PCBs 同系物中有78 种因分子存在手性轴而具有手性，其中19 种可在室温下稳定存在[3]。根据全世界公布的生产数据：手性PCBs的制造总量达29 500吨，占总PCBs总量的6%[4]。研究表明，普遍存在于动物、植物、昆虫和微生物体内的细胞色素单加氧酶P-450(CYP450)参与PCBs各异构体的生物富集与代谢过程，并具有明显的对映体选择性，这与酶的独特手性活性位点有关[5-6]。并且不同对映体与生物体内酶或受体表面的结合位点的亲和力不同，导致手性化合物对生物体产生的毒性效应也表现为明显的对映体选择性[7]。因此，这些PCBs的对映体在生物蓄积、代谢、转化以及毒性效应等多方面均呈现选择性差异[7-8]。但一直以来，在研究手性 POPs环境行为及生态效应时，一般将其视为单一化合物[9]。而且，几乎所有的环境法规也将其作为单一化合物管理，这可能会高估或者低估该类污染物的生态风险和健康安全效应[5]。

由于对映体具有相同的物理和化学性质(如疏水性、蒸气压、极性等)，因此对环境样品中手性PCBs进行分离测定比较困难，测定过程中需采用专门的手性色谱柱进行分析。此外，环境样品含有较多同系物和其他干扰物质，样品中含有的PCBs单体之间会在分离过程中发生峰共溢现象，对手性化合物的准确测定极其不利。目前，对映体分离方法有气相色谱法、高效液相色谱法和多维气相色谱法等。Chen等[10]利用GC-EI/MS测定了中国南部土壤中的手性PCB 95，136，149，84，132和183，并基本实现了基线分离，该方法采用手性Chirasil-Dex色谱柱对PCB 95，136和149进行分离，BGB-172色谱柱对PCB 84，132和183进行分离。戴守辉等[11]利用Chirasil-Dex与BGB-172色谱柱对莲藕及底泥中的6种PCBs对映体进行分离分析，取得了较好的分离效果，但使用两根色谱柱分离PCBs无形中增加了分析时间和工作量。Virginia等[12]采用中心切割多维气相色谱技术测定生物样品中的手性PCBs，同时考察了3种β-环糊精色谱柱(Chirasil-Dex，BGB-172，BGB-176SE)的分离效果，发现BGB-176SE的分离效果最好，可实现6种手性PCBs的有效分离，但由于多维气相色谱技术普及程度很低，成本较高，不适于常规检测[13]。目前手性PCBs的分析方法还有待改善。近年来，尽管利用手性固定相制成的手性色谱柱拆分手性PCBs 对映体得到不断发展，但不同手性柱仍然只能分离有限的手性单体。

我国是电子垃圾拆解的主要地区之一，近年来大量发达国家的电子废弃物进入我国，这些电子垃圾在一些地区(主要是农村或者城市郊区)进行粗放式的拆解，成为我国环境中PCBs的重要来源，电子垃圾回收地成为我国PCBs污染最为严重的地区之一[14]。PCBs可在鱼类的脂肪组织中富集，尽管已有关于电子垃圾拆解区鱼类中检测到PCBs的报道[15-16]，然而这些研究主要集中于外消旋体，手性PCBs 在鱼类中的选择性富集则少有报道。鲮鱼、鲫鱼和乌鳢是清远城镇居民经常食用的鱼类，可以有效反映当地居民经食鱼类而发生PCBs的暴露风险。本研究利用气相色谱-质谱法对比研究了CP-Chirasil，BateDex-325，Cyclosil-B，Chirasil-Dex和BGB-172SE等商用手性色谱柱对7种典型手性PCBs的分离效果，以期实现7种手性PCBs单体的拆分，并采用本文所建立的方法对电子垃圾拆解区池塘中的鲮鱼、鲫鱼和乌鳢样品中7种典型的手性PCBs进行了拆分测定，对手性单体的手性特征进行了探讨。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

加速溶剂萃取仪(Dionex ASE 350，USA)，氮吹浓缩仪(Organomation Associates，USA)，旋转蒸发仪(Heidolph，Germany)，层析柱(酸性硅胶柱，复合硅胶柱，碱性氧化铝柱)。

手性PCBs 标准品(纯度>97%，美国AccuStandard 公司)；二氯甲烷(农残级)、正己烷(农残级)、无水甲醇(分析纯)、丙酮(农残纯)均购自美国Fisher公司；柱层析硅胶(试剂纯，100～200 目，青岛海洋化工厂)，碱性氧化铝(100～200 目，上海五四化学试剂厂)；硝酸银(分析纯)、浓硫酸(优级纯)、无水硫酸钠(优级纯)均购自北京北化精细化学品有限责任公司。

1.2 样品的采集

抽样地点位于清远市龙塘镇，广州市以北约50 km。 据估计，该地区电子垃圾拆解的车间有1 300间，工人8万名，每年拆解的电子垃圾达170万吨。底栖性鱼类样品于2016年同时采集于广东省清远市龙塘镇某电子垃圾拆卸场附近水塘。鲮鱼(Cirrhinusmoliorella,n=7)、鲫鱼(Carassiusauratus,n=7)和乌鳢(Ophicephalusargu,n=7)采完后冰浴运输至实验室放入-20 ℃冰柜保存，实验前取出解冻，取鱼肉(不包含鱼皮)匀浆后，冷冻干燥。

1.3 仪器参数

手性PCBs 的分析采用Agilent 7890B-5975N 型气相色谱-质谱联用仪(美国Agilent公司)， 使用Cyclosil-B(30 m× 0.25 mm × 0.25 μm)色谱柱进行拆分。选择离子扫描模式(SIM)，不分流进样，进样量1 μL。载气为高纯氦气，进样口温度为270 ℃，柱流速为1.0 mL·min-1。升温程序:起始温度100 ℃，保持1 min，10 ℃·min-1升温至200 ℃，保持1 min，再以1 ℃·min-1升温至220 ℃，并保持30 min。电离方式为电子轰击(EI)，70 eV，质谱扫描范围为50～450 amu，传输线温度为250 ℃，离子源温度为230 ℃，四极杆温度为150 ℃。

1.4 样品提取与净化

对鱼样品中目标物的提取采用加速溶剂萃取法(ASE350，Dionex，USA)。鱼肉样品解冻后，用万能粉碎机粉碎搅匀。称取约8.0 g 干燥后的样品置于烧杯中，与质量比为1∶3的硅藻土充分混合，转入底部垫有滤膜的提取筒中。提取溶剂为正己烷-二氯甲烷( 1∶1，体积比)，温度为120 ℃，压力为1 500 psi，静态提取时间10 min，循环提取3 次。溶剂淋洗体积为70% 萃取池体积，氮气吹扫时间为120 s。提取完的溶液用活化的铜片除硫。加速溶剂提取后的样品浓缩液经过凝胶渗透色谱除脂及大分子物质后，依次通过酸性硅胶柱和复合硅胶柱净化，利用碱性氧化铝柱分离得到PCBs组分，将所得样品浓缩后，转入进样瓶，封装待测。

1.5 分离度(R)及对映体分数(EF)的计算

文献中通常用分离度(R)表示色谱图中目标化合物的分离效果，其计算公式为:R=1.18(tR2-tR1)/(W1/2(1)+W1/2(2))[12]，式中tR1和tR2为1对对映体的保留值，W1/2(1)和W1/2(2)为对应的半峰宽。

PCB 在环境样品中的手性组成一般用对映体分数(EF)表示，其计算公式为:EF=A1/(A1+A2)[5，17]，当手性PCBs 在色谱柱上的出峰顺序不确定时，A1表示手性化合物第1个出峰的对映体浓度，A2表示第2 个出峰的对映体浓度；当手性PCBs 的出峰顺序确定时，A1表示(+)对映体浓度，A2表示(-)对映体浓度；当EF为0.5 时，表明手性单体为外消旋体。本研究中PCB 136，PCB149，PCB91和PCB95的出峰顺序确定，其中PCB136 和PCB149为(-)对映体先出峰，PCB91和PCB95为(+)对映体先出峰[18-19]，其余PCBs对映体出峰顺序未确定。

2 结果与讨论

2.1 手性PCBs对映体的拆分

图1 手性PCBs在Cyclosil-B毛细管柱上的拆分色谱图Fig.1 Chromatogram of chiral PCBs separated by Cyclosil-B column

为了实现7种手性PCBs单体的同时分离测定，本研究选择5种含不同固定相的手性柱，分别为BateDex-325(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，CP-Chirasil(25 m×0.25 mm×0.25 μm)，BGB-172SE(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，Chirasil-Dex(30 m×0.25 mm×0.25 μm)和Cyclosil-B(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，在最优化色谱条件下对7种手性PCBs进行拆分。结果显示，手性PCBs标准品在BateDex-325上的拆分效果最差，仅PCB-174可实现拆分，其分离度为0.7(见表1)；4种手性PCBs标准品(PCB 91，PCB132，PCB 136和PCB 149)在CP-Chirasil色谱柱上的分离效果较好，其分离度为0.9～1.6；BGB-172SE和Chirasil-Dex分别可以实现5种和6种手性PCBs的分离，其分离度分别为0.6～1.6和0.6～2.1；手性PCBs标准品PCB 45，PCB 91，PCB 95，PCB132，PCB 136，PCB 149和PCB 174可在Cyclosil-B手性毛细管柱上获得良好的拆分效果，其分离度为0.8～2.3(见图1)。结果表明，使用Cyclosil-B毛细管柱进行分离时，对手性PCBs 拆分的分离度较高。采用Cyclosil-B毛细管柱，对色谱条件进行优化，并对7种手性PCBs 单体的标准品进行全扫描,以确定每个目标物的保留时间及特征离子(见表2)。

表1 手性PCBs 在5根毛细管柱上的分离度(R)

表2 手性PCBs 的扫描离子及保留时间

*quantitation ion

2.2 方法确认

配制浓度梯度依次为10，20，50，100，200 μg·L-1的7种PCBs的标准溶液，按照“1.3”设置仪器参数，分别测定7种PCBs对映体，以峰面积(y)对其质量浓度(x,μg/L)进行线性回归，得到峰面积～浓度校准曲线。14种目标化合物回归方程的线性关系良好，相关系数为0.998～1.000。按照“1.3”的仪器参数和“1.4”样品前处理方法，得到7 种PCBs 的方法检出限(S/N=3)为0.4～5.0 ng·g-1。在经前处理后的空白鱼肉样品(提取净化后浓缩液中手性PCBs的浓度低于检出限)中加入10 μg·L-1和100 μg·L-1的混合标准溶液混合均匀，做基质加标实验，每个基质加标空白鱼肉样平行测定7次，测得回收率为89.2%～114%，相对标准偏差(RSD)为0.3%～2.1%，表明本实验所建立的方法对PCBs 的回收率较好，准确度较高。

2.3 生物样品中PCBs 的手性特征测定

利用本方法在清远市龙塘镇某电子垃圾拆卸场附近水塘所采集的鲮鱼、鲫鱼和乌鳢鱼肉组织内检测到高含量的手性PCBs(表3)，7种手性PCBs的总浓度为386.7～602.8 ng·g-1，高于美国环保署(USEPA)规定的鱼肉组织中PCBs 含量限值(20 ng·g-1)湿重的标准，表明鱼类在该电子垃圾拆解区由于不规范的拆解活动已受到严重污染。鲮鱼、鲫鱼和乌鳢鱼肉组织中具有相似的PCBs同族体组成，均以PCB 91，PCB 95，PCB 132，PCB 136 和PCB 149为主，占7种手性PCBs总量的90%以上。除PCB 149对映体在鲮鱼、鲫鱼和乌鳢鱼3种鱼肉组织中不存在显著的浓度差异外，1-PCB 45，(-)PCB 91，(-)PCB 95，(-)PCB 132和(-)PCB 136在3种鱼肉组织中均高于其相应的对映体，但1-PCB 174在乌鳢体内的浓度低于其相应的对映体2-PCB 174。

表3 鱼肉样品中7种手性PCBs的含量(n=7，湿重)

采用本方法对鱼肉组织中7种手性PCBs 的EF值进行测定，结果显示，PCB 45，PCB 91，PCB 95，PCB 132， PCB 136 和PCB 174的EF 值与标准品存在显著差异，表明这些手性PCBs 在鱼类体内可能具有对映体选择性富集和代谢作用，PCB 149 的EF 值与标准品无明显差异，以外消旋体存在于鲫鱼和鲮鱼体内。

从鱼肉样品中手性PCBs EFs值的箱线图(图2)可以看出，不同种类的鱼肉样品的EF值不同，说明它们对PCBs的富集能力不同，这可能与其生活习性和所处的营养级不同有关。鲮鱼和鲫鱼具有相似的营养级，乌鳢处在较高的营养级。鲮鱼的食物以浮游植物为主，喜舐刮沉积物上的附着物，同时也摄取腐殖质和其他有机碎屑，是一种食草性鱼类。鲫鱼是以植物为食的杂食性鱼类。乌鳢的食物主要以鲮鱼、鲫鱼等其他较小鱼类为主，是一种肉食性鱼类。乌鳢体内的手性PCBs的EFs值显著低于鲮鱼和鲫鱼(PCB 174除外)，可能是由于乌鳢以鲮鱼、鲫鱼等其他鱼类为食物，这些化合物通过食物链的生物放大效应导致了其较低的EFs值。PCB 174的EF值在乌鳢体内大于标准品，而在鲮鱼、鲫鱼体内却小于标准品，这可能是因为乌鳢虽然通过捕食鲮鱼、鲫鱼等其他鱼类，通过生物放大作用获得了食物中的手性特征，但乌鳢自身可选择性地富集代谢不同的对映体，通过自身选择代谢而获得的手性特征强于从食物中获得的手性特征。

3 结 论

本文采用气相色谱-质谱法对比研究了5种商用手性色谱柱对7种典型的手性PCBs的分离效果，结果表明，Cyclosil-B毛细管柱可同时实现标样中7 种手性PCBs的拆分。方法具有较高的灵敏度、准确性和重现性，这对进一步研究手性PCBs 对映体的选择性环境行为和生物毒性差异具有重要意义。应用本方法在电子垃圾拆解区鱼肉样品中可检测到7种手性PCBs，表明该区域不规范的电子垃圾拆解活动已造成鱼类乃至水体的污染，需引起相关部门的重视。通过对鱼肉组织中7种手性PCBs 的EF值进行测定，表明在鱼类的体内，手性PCBs具有对映体选择性富集和代谢作用，本方法适用于多种鱼肉样品中痕量手性PCBs的拆分。

图2 标准品及鱼肉样品中手性PCBs的EFs值

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Enantiomeric Separation of Chiral Polychlorinated Biphenyls in Fish Samples

ZHU Shuai*,RAO Zhu

(National Research Center for Geoanalysis,Beijing 100037,China)

A method was developed for the separation and determination of 7 chiral polychlorinated biphenyls(PCBs) congeners(PCB 45,PCB 91,PCB 95,PCB 132,PCB 136,PCB 149 and PCB 174) in fish samples.The target chemicals were extracted by accelerated solvent extraction，cleaned up by gel permeation chromatography,acidified with silica gel column and multi-layer silica gel column，and were further fractioned with alkaline alumina columns．The chiral PCBs were identified and quantified by gas chromatography-mass spectrometry with electron impact ion source(GC-EI/MS).Five commercially available chiral capillary gas chromatography columns(BateDex-325,CP-Chirasil,BGB-172SE,Chirasil-Dex and Cyclosil-B) were evaluated for their ability to separate enantiomers of 7 chiral PCBs.Among the columns studied,Cyclosil-B capillary column obtained the best results,providing the simultaneous separation of 7 chiral PCBs with the enantioselective resolution of 0.8-2.3.The calibration curves of these seven chiral PCBs showed good linearities in the range of 10-200 μg·L-1with correlation coefficients 0.998-1.000.The limits of detection(LOD,S/N=3) were all below 5.0 ng·g-1.The method was applied in the determination of the analytes in spiked fish samples,with recoveries of of 89.2%-114% and relative standard deviations(RSDs,n=7) of 0.3%- 2.1%，suggesting the high degree of accuracy and efficiency of the established method．The developed method was applied in fish samples which collected from a reservoir surrounded by several e-waste recycling workshops in Guangdong.PCBs and enantiomer franctions(EFs) of chiral PCBs(PCB 45,PCB 91,PCB 95,PCB132,PCB 136,PCB 149 and PCB 174) were analyzed in three kinds of fish samples.The concentrations of chiral PCBs ranged from 386.7 ng·g-1to 602.8 ng·g-1in fish smaples.The EF values of chiral PCBs(PCB 45,PCB 91,PCB 95,PCB 132,PCB 136 and PCB 174) were significantly different with those in standard solution,which meaned that these chiral PCBs had enantioselective enrichment and metabolism in fish tissue.In addition,the EF values of chiral PCBs of PCB 45,PCB 91,PCB 95,PCB 132 and PCB 136 in three kinds of fish tissue were similar,with an exception of PCB 174．The declined EFs of PCB 174 inCirrhinusmoliorellaand Cirrhinus moliorella were rebounded inOphicephalusargu.This result may suggest that theOphicephalusarguandCirrhinusmoliorellaorCarassiusauratuspreferred to biotransform different enantiomers of PCB congeners.

chiral;polychlorinated biphenyl;gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS);fish sample;enantiomer separation

2017-02-03；

2017-03-03

中国地质科学院基本科研业务费专项经费(CSJ201603)；国家自然科学基金(21607033)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.06.007

O657.63;TQ241.31

A

1004-4957(2017)06-0744-07

*通讯作者：朱 帅，硕士，研究方向：持久性有机污染物的分析方法与环境行为研究，Tel:010-68999590，E-mail:zhu15131215153@ 126.com