不同化学萃取次数对同种异体肌腱生物学性能的影响

陈鹏，江长青，申丽，陈国飞，尤田，江小成，李伟，

（1.北京大学深圳医院 运动医学科，广东 深圳 518036；2.深圳市坪山区妇幼保健院 检验科，广东 深圳 518000；3.深圳市光明新区人民医院 骨科，广东 深圳 518000）

肌腱损伤及肌腱缺损是临床上常见的创伤性疾病[1]，肌腱移植是其主要的修复手段。自体肌腱不存在排斥反应，是修复肌腱缺损的最好方法，也是临床中最常用的肌腱移植替代物。但由于自体肌腱来源有限，很多情况下无法满足临床需要，尤其是多发韧带损伤的患者。组织工程肌腱目前仍处于试验阶段，因其生物相容性及力学强度等难题仍未克服，尚无法大规模应用于临床[2]。同种异体肌腱来源相对比较充足，应用方便，而且不对患者造成二次损伤，又可以根据患者的具体伤情选择相应长短、粗细的肌腱，所以同种异体肌腱移植是目前肌腱修复或重建的主要方法。

寻求生物活性好、力学强度高且免疫原性低的同种异体肌腱是目前需要解决的重点和难点问题。目前同种异体肌腱的制备方法主要有深低温冻存法、深低温冻存干燥法、乙醇浸泡法等[3]，但上述方法不能从根本上解决免疫原性和肌腱力学强度等问题。化学萃取是利用阴离子表面活性剂磷酸三丁酯(TBP)对肌腱组织进行脱细胞处理。本实验深入探讨不同次数化学萃取法在同种异体肌腱制备中的应用效果。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

新西兰大白兔，体重2.5～3.0 kg，雄性，共16只，由北京华阜康生物科技股份有限责任公司提供。将实验动物平均分为四组：A组：萃取一遍；B组：萃取两遍；C组：萃取三遍；D组：不经任何处理。

1.2 实验步骤

1.2.1 动物适应性喂养

动物房12 h昼夜交替，保持新西兰大白兔自由饮水、进食，温度23℃～25℃，适应性喂养一周后进入实验。

1.2.2 跟腱取材

新西兰大白兔7%水合氯醛耳缘静脉注射麻醉，后腿备皮，剪开腿部皮肤，暴露肌肉组织以及肌腱，分离肌肉充分暴露肌腱，剪下肌腱，注意避免操作过程中夹取或牵拉肌腱。

1.2.3 跟腱萃取

萃取方法：⑴肌腱于200 mL无菌蒸馏水中水平振荡6h，无菌蒸馏水冲洗3遍；⑵4%Triton X-100约200 mL中水平振荡12 h，无菌蒸馏水再次冲洗3遍；⑶重复第一步；⑷4%脱氧胆酸钠液约200 mL中振荡12 h，无菌蒸馏水冲洗3遍；⑸最后在无菌蒸馏水200 mL中水平振荡12 h。

1.2.4 萃取频率

A组：按方法萃取一遍；B组：按方法萃取两遍；C组：按方法萃取三遍；D组：将未经任何处理的去除结缔组织的肌腱作为对照组。

1.2.5 肌腱组织HE染色

标本经固定及石蜡包埋后做成石蜡切片，行苏木精-伊红染色，再脱水封片，光镜下观察。

1.2.6 样品导电处理及电镜观察

标本用戊二醛固定及梯度酒精脱水后，浸入50%的乙腈溶液中，然后依次更换70%，80%，90%，95%、100%的乙腈溶液，每次浸泡 1 5～20 min，最后更换100%乙腈溶液。进行真空干燥，静置30 min。待样品干燥，温度升至室温后，取出样品。用真空喷镀法。所用的仪器为真空喷镀仪，样品进行旋转活动，先喷碳，后喷金，喷镀均匀，完成后电镜下观察。

1.2.7 生物力学检测

肌腱拉伸断裂强度检测中，肌腱两端用纱布包裹，然后将其固定在检测仪两端，检测时用生理盐水不断喷湿肌腱，防止风干对实验结果造成影响。将肌腱拉伸至完全断裂，拉伸速度为10 mm/min，在肌腱拉伸断裂检测过程中，用相应软件详细记录结果；在检测肌腱拉伸断裂延伸率过程中，延伸率计算方法为（拉伸断裂长度-初始长度）/初始长度×100%[4]。

1.2.8 混合淋巴细胞培养测定

用含0.2%胶原酶RPM I 1640液将四组肌腱标本切碎后分别消化，分离获得其中的细胞成分，将浓度调整为1×106/mL，作为刺激细胞；采取受体兔静脉血，分离获取其淋巴细胞，将浓度调整为1×106/mL，作为反应细胞。将刺激细胞与反应细胞分别等量混合培养，各组做6个复孔，混合培养7 d后，获取细胞悬液，离心后将沉淀制片，行瑞姬氏染色，光镜下计数总淋巴细胞数 (约500个)及转化细胞数，转化率计算方法如下：

淋巴细胞转化率 =转化淋巴细胞数/计数的淋巴细胞总数×100%。

计算各组6个复孔转化率并计算其均值，作为此组转化率。分别取4只供体兔肌腱标本及4只受体兔静脉血试验。

1.3 统计学分析

所有数据以（±s）形式表示，以SPSS 13.0统计软件（SPSS公司，美国）进行统计学分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组织形态学

2.1.1 大体观察

D组肌腱为表面光滑的长条状乳白色组织，纵截面长径3.6～4.7 mm，短径1.0～1.6 mm，质地较柔软，弹性、韧性良好，肌腱完整无损；A组外观与D组基本相同；B组肌腱为表面光滑的长条状瓷白色组织，弹性及韧性稍逊于D组肌腱，基本完好无损；C组肌腱为无光泽的长条状瓷白色组织，表面较粗糙，弹性及韧性明显较D组肌腱差，部分肌腱纤维松散。

2.1.2 HE染色

A组肌腱束间可见疏松结缔组织，胶原纤维平行排列成束；B组肌腱束间可见疏松结缔组织，胶原纤维平行排列成束，偶可见胶原纤维中断；C组肌腱束间隔不清，胶原纤维排列较混乱；D组肌腱束间可见疏松结缔组织，胶原纤维平行排列成束，其间可见散在腱细胞（图1）。

图1 四组HE染色后肌腱束比较（×400）

2.1.3 电镜观察

A组肌腱：有少许残留细胞，细胞无明显肿胀，胶原纤维排列较规则，呈波浪形，部分肌腱纤维轻度肿胀，纤维间隙稍增大（图2-A）。B组肌腱：无残留细胞，胶原纤维排列较规则，大多呈波浪形，肌腱纤维之间相互交联，部分纤维较肿胀（图2-B）。C组肌腱：无残留细胞，胶原纤维之间排列较紊乱，无规则形状，纤维间相互交织，纤维肿胀明显（图2-C）。D组肌腱：细胞无肿胀，胶原纤维排列较规则、紧密，纤维粗细均匀，呈波浪形，纤维之间相互交织（图2-D）。

图2 四组扫描电镜下肌腱比较（×1000）。

2.2 生物力学检测

检测结果见表1，肌腱拉伸断裂强度(Pmax)、功耗(Wmax)、延伸率(＆max)各实验组间差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.3 混合淋巴细胞培养测定

C组淋巴细胞转化率（1.21±0.19）%，显著低于A组（5.36±0.54）%、B 组（3.84±0.36）%及D组（P＜0.05）；B组淋巴细胞转化率也低于A组（P＜0.05）（表2）。说明化学萃取法几乎消除了肌腱的免疫源性，萃取次数越多，肌腱的免疫原性越低。

表1 四组肌腱生物力学检测结果(n=4，±s)

表1 四组肌腱生物力学检测结果(n=4，±s)

组别 Pmax(N) Wmax(J) ＆max(%)A 组 173±36 0.68±0.09 21.15±1.65 B 组 168±31 0.62±0.07 20.32±1.28 C 组 159±35 0.53±0.10 18.86±1.37 D 组 176±23 0.73±0.08 22.04±1.31 F值 0.379 0.957 2.844 P值 0.594 0.143 0.095

表2 四组淋巴细胞转化率结果(n=4，±s)

表2 四组淋巴细胞转化率结果(n=4，±s)

组别 转化率（%）A组 5.36±0.54 B组 3.84±0.36 C组 1.21±0.19 D组 10.59±0.67 F值 0.247 P值 ＜0.001

3 讨论

临床中，肌腱移植在外科重建与修复中应用广泛，无论是运动医学科还是手外科，对肌腱移植材料的需求都很大[3]。目前，肌腱移植材料主要分为自体肌腱、同种异体肌腱、组织工程肌腱以及人工肌腱等[6，7]。自体肌腱移植虽排斥反应较小，但因其来源有限且有创，无法满足临床需要。同种异体肌腱来源广泛，且不会造成新的创伤，近年来一直是组织工程研究中的热点。

目前来说，限制同种异体肌腱应用主要有两方面因素。一是肌腱本身的免疫原性。若未经免疫原性处理的肌腱植入受体内，将会引起严重的排斥反应，导致手术失败甚至危及受体生命安全。二是经处理后肌腱的强度变化。本质上说，肌腱在体内就是起到力量传递作用，所以肌腱本身必须保持一定的抗拉伸强度及韧度，若肌腱经处理后强度下降较大，也将直接导致手术的失败[4]。

本实验中，A组及B组均与D组有相似的形态、色泽及拉伸断裂强度。实验组在很大程度上保留了肌腱纤维强度的同时，去除了肌腱的免疫原性，使其能够被异体接受。HE染色及电镜下观察，C组肌腱纤维组织破坏较严重，肌腱纤维排列紊乱，而萃取一遍及二遍组肌腱的纤维可以得到较完整的保留。

肌腱移植材料最重要的是要具备良好的生物力学性能，这样才可以减少手术过程中缝合时的撕裂程度[3]，进而减少术后再断裂的概率，降低手术失败率[8,9]。本实验中通过力学实验测试来探讨经不同萃取次数制备的肌腱对其生物力学性能有无影响，四组肌腱的Pmax、Wmax和＆max的结果差异无统计学意义 (P＞0.05)，表明四组间力学强度未见明显差异，化学萃取法制备的肌腱能够较好地保留肌腱的生物力学性能。但萃取三遍组的各项数据均明显低于其他组，可能由于样本量不够大或测试条件等因素，导致结果无统计学差异。

有研究表明CD 4+T，CD 8+T两个淋巴细胞亚群参与机体免疫排斥反应主要是通过细胞免疫和体液免疫两个过程协同作用[10]，临床上二者比值的变化常作为检测移植物引起的排斥反应的指标[11]。本实验中，混合淋巴细胞培养结果显示，四组之间淋巴细胞转化率均有明显差异，空白组淋巴细胞转化率最大，萃取三遍组转化率明显低于其他各组（P＜0.05），萃取二遍组转化率明显低于萃取一遍组。说明萃取次数越多，肌腱的免疫原性降低越明显。

综上所述，肌腱经化学萃取法萃取二遍后，在保留了原有的肌腱纤维和良好的生物力学性能的同时，也明显降低了其免疫原性，是一种相对较好的肌腱制备方法，为同种异体肌腱制备的进一步研究奠定基础。

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