高效液相色谱法测定市售坚果中苦杏仁苷含量

□ 都鹏飞 杭州贝因美母婴营养品有限公司 熊丽娜 贝因美（杭州）食品研究院有限公司 林加建 杭州贝因美母婴营养品有限公司

高效液相色谱法测定市售坚果中苦杏仁苷含量

□ 都鹏飞 杭州贝因美母婴营养品有限公司 熊丽娜 贝因美（杭州）食品研究院有限公司 林加建 杭州贝因美母婴营养品有限公司

本文通过采用PhenomenexSynergi 4u hydro-RP 80A(250×4.6mm)色谱柱，以甲醇-水（23∶77）为流动相进行等度洗脱，流速为0.7 mL/min，进样量10 μL，检测波长217 nm，柱温25 ℃，建立了适用于榛子、核桃、杏仁和腰果中苦杏仁苷检测的方法，得到苦杏仁苷标准曲线回归方程为y=9.518 6x-21.042，在进样质量浓度为20～320 μg/mL时线性关系良好，R2=0.999 6，平均回收率为97.22%，RSD为4.3%，方法操作简便、结果准确。结果发现杏仁中苦杏仁苷含量最高，达442.71～814.26 mg/kg；核桃次之，含量为318.35 mg/kg，腰果及榛子中含量相对较低，分别为47.61～98.36 mg/kg、79.45～125.83mg/kg，苦杏仁苷含量与坚果产地密切相关，研究结果为坚果中有害物质的风险评估提供理论依据，

高效液相色谱；坚果；苦杏仁苷

榛子、核桃、杏仁和腰果，被称为“世界四大坚果”，也是我国重要的经济林作物。坚果中含有丰富的不饱和脂肪酸、蛋白质和酚类，目前对其研究主要集中在营养方面，对于潜在的风险成分分析罕有研究。苦杏仁苷广泛存在于蔷薇科种子，在人体内经酶的作用发生水解产生游离的氢氰酸和小分子酮而产生严重危害。以中药材如苦杏仁等为对象，其中苦杏仁苷的HPLC分析检测文献报道较多[1-2]，但对于坚果中定量检测报道较少。坚果消费量大面广，对其中苦杏仁苷含量进行分析和风险评估具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

来自不同产地的四种市售坚果：杏仁：分别产自山东、河北、新疆、四川、辽宁；核桃：产自云南、陕西、山东、新疆；榛子：产自美国、中国辽宁；腰果：产自越南、东北；苦杏仁苷标准品（纯度>98%）

1.2 仪器与设备

Agilent1100高效液相色谱仪（G1314A VDW检测器）；BSA124SCW分析天平；KQ-250B超声波清洗器；RE-52AA旋转蒸发器；DGX-9143B-2鼓风干燥箱；A111BS25研磨机；TU-1810紫外可见分光光度计。

1.3 方法

1.3.1 对照品溶液配制

精密称取0.010 0 g苦杏仁苷对照品，以甲醇定容至10 mL，摇匀。

1.3.2 供试样品溶液制备

样品于60 ℃条件下干燥至恒重，捣碎，精确称取2 g，按1∶40料液比用石油醚（沸程60～90 ℃）超声波辅助脱脂30 min，过滤，滤渣风干后以1∶20料液比用甲醇超声浸提60 min，过滤，20 mL甲醇冲洗残渣，合并滤液。滤液经旋转蒸发浓缩并至10 mL，密封后4 ℃贮藏备用。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：PhenomenexSynergi 4μ hydro-RP 80A(250 mm×4.6 mm)；流动相：甲醇-水（23∶77，V/V）；检测波长为217 nm；柱温：25 ℃；流速：0.7 mL/min。以标准品保留时间定性，外标法峰面积定量。

2 结果与分析

2.1 色谱条件选择

2.1.1 检测波长确定

苦杏仁苷紫外可见光区扫描图见图2a，通过紫外可见分光光度计扫描，苦杏仁苷在紫外光区有吸收，最大吸收波长为217 nm，与文献报道的210 nm，215 nm接近[1-2]。

2.1.2 流动相比例及流速确定

样品中苦杏仁苷分离效果图见图2b，通过调整流动相比例(甲醇与水比例分别为30∶70、25∶75、23∶77、22∶78)，得出在流动相为甲醇与水体积比23∶77，流速0.7 mL/min条件下，样品中苦杏仁吸收峰与其他杂质峰均可得到较好的分离。

2.2 方法学验证

2.2.1 线性关系考察

分别配制20、40、80、160 μg/ mL和320 μg/mL苦杏仁苷标准品溶液，分别进样2次，每次10 μL，以浓度与平均峰面积分别为横纵坐标，得回归方程：y=9.518 6x-21.042，相关系数R2=0.9996。

2.2.2 精密度试验

取对照品溶液，按1.3.3设定色谱条件平行进样5次，每次10 μL，经HPLC分析得峰面积分别为3 038.4，3 047.5，3 069.7，3 004.4，3 006.9，RSD为0.92%。

2.2.3 重复性验证

准确称取辽宁杏仁5份各2 g，按1.3.2样品处理方法平行处理，分别进样测定，测得峰面积分别为1 569.1、1 570.4、1 510.9、1 549.5、1 502.9，RSD为2.04%。

2.2.4 加样回收率验证

取已知苦杏仁苷含量的杏仁5份各2 g，分别加入一定量苦杏仁苷标准品，进样测定并计算得回收率分别为94.20%、92.80%、103.50%、96.50%、99.10%，平均回收率为97.22%，RSD为4.3%。

方法学验证结果显示本文采用的提取方法及测定条件适用于四种坚果中苦杏仁苷的定量测定。

2.3 样品测定结果

各种样品测定结果见表1。从表1我们可发现，杏仁中苦杏仁苷含量明显高于其他三种坚果，产地与品种对坚果中苦杏仁苷含量有很大的影响。从杏仁看，北方产比南方产苦杏仁苷含量高；对核桃而言，陕西核桃中苦杏仁苷含量318.35 μg/g。苦杏仁苷小鼠口服最大耐受量为75 mg/kg[3]，而辽宁产杏仁中苦杏仁苷含量高达814 mg/kg，证明一次性食用过量杏仁将对人体产生危害，其他品种坚果亦是如此。

3 结论

通过研究发现，市售常见坚果中苦杏仁苷含量较高，可达47.61~814 mg/kg，若食用量大，易导致中毒，因此必须控制坚果一次性摄入量。本文所选样品为未经加工的生坚果，而在加工过程中通过机械、热力或微生物作用，坚果组织细胞破坏，苦杏仁苷会发生分解而使摄入体内的量减少。因此适当的加工利于减少危害。但是，剧烈的加工条件易造成营养物质的流失。因此，寻找既不破坏营养成分，又能减少有害物质的加工方法势在必行。同时，对于各加工与流通环节苦杏仁苷含量的监控与风险分析也必不可少。

图2 a 苦杏仁苷紫外可见光区扫描图

图2 b 样品中苦杏仁苷分离效果图

表1 不同种类及产地坚果中苦杏仁苷测定结果

[1]FATMA A Y ,M. ATILLA A. Variability of amygdalin content in seeds of sweet andbitter apricot cultivars in Turkey[J]. African Journal of Biotechnology, 2010, 9(39):6522-6524.

[2]叶晶晶.HPLC法测定不同产地桃仁中苦杏仁苷的含量[J].中华中医药学刊,2011,29(1):206-207.

[3]郭晓庄.有毒中草药大辞典[M].天津:科技翻译出版公司,1992:292.

熊丽娜。