IGF-1转染自体骨髓间充质干细胞移植促进兔胫骨牵张成骨实验研究

吴卫宾，任志勇，宋君，张维彬，魏长月

（1.阳光融和医院 骨科，山东 潍坊 261000；2.中国人民解放军第89医院 骨科，山东 潍坊 261021）

因外伤等各种原因致四肢长骨大段缺损较为常见，临床上有较多的方法治疗，而Ilizarov技术是由前苏联医学专家Gavriil Ilizarov于1952年设计并初步应用于临床。该技术的理念是在损伤肢体用钢针贯穿固定骨骼的几个平面，Ilizarov外固定器连接固定，但需较长的外固定时间，有骨质疏松、针道感染等各种并发症存在。而解决并发症则需缩短外固定架的固定时间，然而牵张成骨区成骨质量必须尽早接近或达到正常就显得尤为重要。近年来组织工程技术的迅猛发展，IGF-1在成骨于骨生长中起到非常重要的骨代谢平衡调节，参与了整个生命周期[1,2]。Johansson等[3]发现IGF-1既可增加成骨细胞的合成、分泌，又可加强破骨细胞的功能，但对成骨细胞作用更强，使骨质增多，骨密度增加。任志勇等[4]在实验中设计兔胫骨模型牵张成骨应用骨形态蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞证明了有促进骨形成及提高骨质量作用。因此，我们通过分别将兔胫骨干骺端截骨，应用Ilizarov技术制作兔胫骨牵张成骨模型，在固定期内第2天实验组分别注入IGF-1转染的自体骨髓间充质干细胞于兔胫骨牵张延长区间隙内，验证IGF-1转染的自体骨髓间充质干细胞移植是否有促进对兔胫骨牵张成骨骨形成质量的作用，并为临床提供重要参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

健康新西兰白兔48只，体重（2.5±0.2）kg，（9±1）周龄，雄性，由中国人民解放军第89医院动物实验中心提供。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物分组

健康新西兰白兔随机分三组，每组16只，A组为实验组：固定期第2天于牵张成骨区间隙内注入IGF-1转染的自体骨髓间充质干细胞200μL。B组为对照组：于牵张成骨区间隙内注入相同浓度200μL自体骨髓间充质干细胞。C组为空白组：牵张成骨区间隙内不注入任何物质。

1.2.2 兔自体骨髓间充质干细胞的分离和培养

随机取16只新西兰白兔并依次标号1-16号，用5 mL注射器，取稀释的肝素(1×104U/L)1 mL，肌肉注射。消毒后在兔股骨大粗隆顶点用实验骨髓穿刺针抽取股骨骨髓4 mL，直接加入含10%胎牛血清的DMEM培养液5 mL中，置于5%的CO2培养箱内，温度为37℃。3 d后更换一次，半量，此后每2天换液1次，方法同上。80%细胞铺满瓶底时，完全去掉上清液。冲洗：用PBS冲洗1遍后，加入0.25%胰蛋白酶消化2 min等待细胞变圆后，再加含血清DMEM液终止消化，吹打细胞，将兔自体骨髓间充质干细胞培养传代至第P3代细胞，观察细胞生长状态良好。

1.2.3 真核质粒pcDNA3.1-IGF-1转染兔自体骨髓间充质干细胞

利用重组大肠杆菌扩增并提取足够数量空载质粒、重组质粒。将转染48 h后的兔骨髓间充质干细胞FITC标记后在荧光显微镜下观察，转染pcDNA3.1-IGF-1后的骨髓间充质干细胞在荧光镜下呈现绿色，而未转染组及转染空载体pcDNA3.1组未见荧光反应（图 1 ，2）。

图1 转染 pcDNA3.1-IGF-1（FITC标记×20）

图2未转染及转染空载体pcDNA3.1（FITC标记×20）

1.2.4 动物模型的制作

无菌条件下进行，肌注氯胺酮麻醉。沿兔左胫前内侧纵行切开中上1/3皮肤及皮下组织，钝性分离胫前肌，暴露胫骨，在胫骨粗隆下约1.0 cm水平处截骨，分别在截骨面上下各0.5～1.0 cm处穿放两组平行克氏针，将双边外固定架给予固定。截断腓骨，缝合、包扎。术前、术中及术后青霉素肌肉注射预防感染。术后1周开始延长远端穿骨模块，每天牵张1.0 mm，分2次进行，牵张长度共1.0cm。固定期第2天，将相应编号IGF-1基因转染的自体骨髓间充质干细胞200 uL注入兔胫骨模型A组的牵张延长间隙内；B组在牵张延长间隙给予注入相应编号相同浓度的自体骨髓间充质干细胞；C组不予任何物质注入。

1.3 观察指标

1.3.1 影像学观察

各组分别在固定期的第2周末，第6周末行兔左侧胫骨模型全长X线透视，观察牵张成骨延长区的成骨情况。

1.3.2 HE染色观察

固定期第2，6周末在牵张成骨区内取材，HE染色，切成50 um厚切片，光镜下观察组织学变化。

1.3.3 骨密度测定

于第3个月末取各组6只动物标本，用Hologic QDR-2000双能X线骨密度仪(中国人民解放军第89医院影像科)测定骨密度。

1.3.4 结构力学实验

第3个月末取各组6只动物标本，用CSS-4000万能材料测试仪(中国人民解放军第89医院全军创伤骨科研究所生物力学实验室提供）行承受负荷强度、结构刚度、能量吸收结构生物力学测定。

2 结果

2.1 影像学检查

固定期第2周末：X线片示三组牵张成骨兔胫骨模型正位片上，对位对线良好。三组延长区均可见低密度骨痂形成影像，骨痂密度A组略高于B组及C组（图3）。

图3 固定期第2周末X线表现

图4 固定期第6周末X线表现

图5 固定期第2周末HE染色（HE染色×200）

图6 固定期第6周末HE染色（HE染色×100）

固定期第6周末：X线片示三组牵张成骨兔胫骨模型正位片上，对位对线良好。牵张成骨延长区三组新骨形成的数量及骨密度明显增加，填充于整个牵张成骨延长区，骨痂影似由延长区间隙的两端向中央生长，两端有骨皮质征象。延长区可见少量新骨影，呈片状及条索状排列。在X线片上显示A组较B组及C组亮度高（图4）。

2.2 HE染色观察

固定期第2周末：显示A组有少量纤维软骨骨痂形成，B组及C组无纤维软骨骨痂形成，炎性细胞及破骨细胞均减少（图5）。

固定期第6周末：三组均有成熟骨基质及骨小梁，但A组较B组及C组骨细胞增生活跃，软骨肥厚带增大，成骨细胞明显可见密度增加、骨细胞肥大、钙盐沉积均匀，软骨骨痂已向骨性骨痂转变（图6）。

2.3 骨密度测定

牵张成骨固定期3个月后各组随机取6只实验动物标本，Hologic QDR--2000双能X线骨密度仪测定骨密度，用SPSS17.0统计程序在电子计算机上对实验结果进行统计学分析，A组骨密度相对值（%）显著高于B组与C组P＜0.05，差异有统计学意义。B组与C组对比P＞0.05无统计学意义。骨密度值由高到低顺序排列为：A组＞B组＞C组(表1)。说明胰岛素样生长因子1转染的自体骨髓间充质干细胞在兔胫骨牵张成骨实验中可以促进骨生成。

2.4 生物力学测试

牵张成骨固定期3个月后各组取6只实验动物标本行骨密度测定，使用CSS-4000万能材料测试仪行生物力学测定。测定承受负荷强度、结构刚度、能量吸收各项指标，用SPSS 17.0统计程序行统计分析，分析实验数据结果示：A组优于B组和C组P＜0.05，差异有统计学意义。B组与C组对比，P＞0.05无统计学意义。A组载荷强度最大(表2)。生物力学测试数值由高到低顺序排列为：A组＞B组＞C组。说明IGF-1转染的自体骨髓间充质干细胞在兔胫骨牵张成骨实验中可以促进骨生成的质量。

表1 骨密度测试结果(±s)

表1 骨密度测试结果(±s)

Group n BMD相对值（%）A组 6 47.9±23.1 B组 6 28.9±21.2 C组 6 26.8±22.3

表2 结构生物力学差数(±s)

表2 结构生物力学差数(±s)

Group n 最大负荷（N） 结构刚度（N·mm-1） 能量吸收（N·mm）A 组 6 187.35±11.68 207.66±35.73 209.73±26.51 B 组 6 173.87±21.54 189.17±38.34 170.66±29.31 C 组 6 169.97±29.34 185.82±40.53 169.75±20.67

3 讨论

1905年意大利学者Codivila曾报道骨延长术；Ilizarov研究发现了牵张应力对组织生长再生的刺激作用，即牵张再生规律。Hamdy等[5]发现延长区出现牵引纵轴方向排列的胶原纤维和骨小梁，钙化从两端逐渐向中心。Cope等[6]的实验也发现两端向延长区中心逐渐钙化，纤维组织和新生的骨小梁也逐渐增多，在延长后的第42天左右，则可见相对成熟的再生骨组织。Aronson等[7]研究观察肢体延长区的细胞增殖现象，实验中利用增殖细胞核抗原（PCNA）发现骨延长区增殖细胞呈区域分布，细胞的增殖与牵拉作用有关。Ilizarov外固定器连接固定，用于创伤及矫形方面如骨折、骨缺损、肢体延长、关节问题等。牵张成骨过程中成骨区在牵张期与固定早期骨质脆弱，使该项技术需较长的外固定时间，然而有骨质疏松、针道感染等各种并发症存在。这些存在的问题一直让我们探究。

IGF-1具有内分泌和旁分泌特性的单链多肽因子，几乎参与体内每个器官的生长和功能[8-10]。在青春期和成年期IGF-1骨骼发育和成熟方面都起到重要作用，分别参与长骨生长、骨成熟、钙质在骨骼中的沉积和保持骨质密度[11,12]的过程。在出生后及整个青春期，IGF-1和生长激素两个因子对长骨的发育成熟都起着至关重要的作用[13，14]，IGF-1促进骨基质的合成和矿化是多样性的，可以通过不依赖促有丝分裂的途径，影响骨代谢。IGFs还可以显著增加骨吸收与骨形成的偶联作用。鉴于IGF在成骨中的重要作用，科学研究人员将外源性生长因子应用于牵张成骨或骨折愈合区，从而加速骨创伤修复愈合过程，但由于外源性生长因子半衰期短，加之提取困难，价格昂贵等限制性因素的存在，应用效果不尽人意。自体骨髓间充质干细胞不具有免疫原性，且具有取材创伤小、储备多、易培养等优点，经IGF-1基因介导后植入牵张成骨区后可很好地存活增殖，并持续分泌IGF-1，可以很好地避免外源性生长因子应用的限制因素。应用符合Ilizarov骨牵张技术理念外固定架固定，在固定期内第2天于牵张间隙内注入IGF-1基因转染的自体骨髓间充质干细胞，验证IGF-1基因介导的自体骨髓间充质干细胞移植对兔胫骨牵张成骨骨形成质量是否有促进作用未见文献相关报道。

成骨质量与多方面有密切关系，非介入的影像检查是常用的临床检测手段，临床常据此评估骨愈合的质量，决定何时可以安全地拆除外固定器，目前常规的X线片还是最经济、有效的方法。我们于固定期的第2周末，第6周末对各组实验动物分别行牵张成骨区X线摄片。在X线片上显示实验组明显较对照组及空白组亮度高。我们同时在固定期的第2周末及第6周末将牵张成骨区骨组织作了HE染色观察。除此之外我们还在本实验中行骨密度及生物力学测定，实验组均优于对照组及空白组。因此我们推断经IGF-1基因转染的自体骨髓间充质干细胞通过分泌IGF-1对牵张区成骨质量有明显的促进作用。总之，本实验将经IGF-1基因转染的自体骨髓间充质干细胞移植到牵张成骨区，通过干细胞的增殖分泌IGF1促进牵张成骨区成骨质量。但IGF-1相互作用复杂且与多环节相关，目前还需我们进一步实验研究。

[1]Giustina A.Does growth hormone replacement therapyimprove cardiac function[J].Nat Clin Pract EndocrinolMetab,2007,3(9):614-615.

[2]Mazziotti G,A Giustina,E Canalis,et al.Glucocorticoid induced osteoporosis:clinical and therapeutic aspects[J].Arq Bras Endocrinol Metabol,2007,51(8):1404-1412.

[3]Woods KA,C Camacho-Hubner,MO Savage,et al.Intrauterine growth retardation and postnatal growth failure associated with deletion of the insulin-like growth factor I gene[J].N Engl J Med,1996,335(18):1363-1367.

[4]任志勇,邱世超，黄现峰.骨形态发生蛋白2基因修饰自体骨髓间充质干细胞移植促进兔胫骨牵张成骨的实验研究[J].中国矫形外科杂志，2014，22(5)：453-457.

[5]Hamdy RC,Rivard Ch.Histologic evaluation of bone regeneration in cases of limb lengthing by Ilizarov’s technique[D].An experimental study in the dog Ann Chir,1997,51(8):875-883.

[6]Cope JB,Samchukov ML.Regenerate bone formation and remodeling during mandibular osteodistraction[J].Angle Orthop,2000,70(2):99-111.

[7]Aronson J,Shen XC,Gao GG,et al.Sustained proliferation accmpanies distraction osteogenesis in the rats[J].Orthop Res,1997,15(4):563-569.

[8]Kurtoglu S,Kondolot M,Mazicioglu MM,et a1.Growth hormone，insulin like growth factor-1，and insulin-like growth factor-binding protein-3 levels in the neonatal period:a preliminary study[J].Pediatr Endocrinol Metab,2010,23(9)：885-889．

[9]Skamoto T,Nakagawa T,Horie RT,et a1.Inner ear drug delivery system from the clinical point of view[J].Acta Otolaryngol Suppl,2010,5(563):101-104．

[10]Sassoon CS,Zhu E,Fang L,et a1.Interactive efects of corticosteroid and mechanical ventilation on diaphragm muscle function[J]．Muscle Nerve,2011,43(1):103-111．

[11]Baroncelli GI,S Bertelloni,FSodini,etal.Acquisition of bone mass in normal individuals and in paticrinol Metab,2003,16(2):327-335.

[12]Monson JP,WM Drake,PV Carroll,et al.Influence of growth hormone on accretion of bone mass[J].Horm Res,2002,58(1):52-56.

[13]Codrons V,F Vanderbist,RK Verbeeck,et al.Systemic delivery of parathyroid hormone(1-34)using inhalation dry powders in rats[J].Pharm Sci,2003,92(5):938-950.

[14]Guler HP,J Zapf,E Scheiwiller,et al.Recombinant human insulin-like growth factor I stimulates growth and has distinct effects on organ size in hypophysectomized rats[J].Proc Natl Acad Sci USA,1988,85(13):4889-4893.