胞核内高表达M—CSF对HeLa细胞生长增殖的影响

李旎　詹向阳　陈艳华

[摘要] 目的 分析人宫颈癌HeLa细胞核内M-CSF增高对化疗药物的影响。 方法 体外培养HeLa细胞、HeLa-M细胞以及转染M-CSF空载体HeLa-C细胞。分别使用紫杉醇和顺铂（浓度分别为0.3、3、30 μg/mL）作用48 h，采用MTT方法比较细胞的相对活性，Westen blot分析转染M-CSF对抗凋亡分子Bcl-2表达的影响。 结果 当两种化疗药物的浓度为3、30 μg/mL时，与HeLa-C细胞和HeLa细胞相比，HeLa-M细胞活性明显增高，差异有统计学意义（P<0.05）；当浓度为0.3 μg/mL时三种细胞活性无明显差异。Westen blot结果显示，转染M-CSF后能够使细胞中的抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平明显升高。 结论 人宫颈癌HeLa细胞核中的M-CSF增高可以使细胞的药抗性提高，从而抑制HeLa细胞的凋亡。

[关键词] 人宫颈癌；HeLa细胞核；M-CSF；化疗药物

[中图分类号] R73 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）16-0030-03

[Abstract] Objective To analyze the effect of elevated M-CSF in nuclei on the chemotherapeutic drugs of human cervical cancer HeLa cells. Methods HeLa cells， HeLa-M cells and HeLa-C transfected with M-CSF empty vector were cultured in vitro. The paclitaxel and cisplatin（concentrations were 0.3， 3， 30 μg/mL） were used for 48 h， respectively. The relative viability of the cells was compared by MTT method. The effect of transfection with M-CSF on the expression of Bcl-2 was detected by Western blot analysis. The effect of paclitaxel and cisplatin （concentration 0.3， 3， 30 μg/mL） on the expression of anti-apoptotic molecule Bcl-2 was detected by MTT method. Results The viability of HeLa-M cells was significantly higher than that of HeLa-C cells and HeLa cells when the concentration of the two chemotherapeutic drugs was 3， 30 μg/mL， and the difference was statistically significant（P<0.05）. There was no significant difference in cell viability between the three kinds of cells when the concentration was 0.3 μg/mL. The results of Western blot showed that the expression of anti-apoptotic protein Bcl-2 was significantly increased after transfection with M-CSF. Conclusion The increase of M-CSF in the nucleus of human cervical cancer HeLa cells can improve the drug resistance of the cells and inhibit the apoptosis of HeLa cells.

[Key words] Human cervical cancer； HeLa nucleus； M-CSF； Chemotherapy drugs

M-CSF即巨噬細胞集落刺激因子，简称集落刺激因子[1]，主要是由链间二硫键所形成的同源二聚体糖蛋白，其与CSF-1R相互作用会使受体发生二聚化反应，随后可以与细胞内的多条信号通路发生相应的作用，比如JAK/STAT等，与不同细胞作用会产生不同的生物学效应[2-3]。2006年时相关学者以小鼠为例，使用抗M-CSF逆转了种植在小鼠身上的MCF-7细胞，这说明在治疗乳腺癌中，抗M-CSF是一种潜在的治疗方法[4]。对妇女而言，宫颈癌是第二种常见的恶性肿瘤疾病，临床上的常见药物为顺铂类药物，但是容易产生耐药性[5-6]。因此，对人宫颈癌HeLa细胞核内的M-CSF研究具有深远的意义。本研究对其进行相应研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

从北京医科大学细胞库中购入人宫颈癌HeLa细胞，转染的HeLa-C细胞以及转染M-CSF细胞等需要在前期通过实验转染得到。所使用的MTT从Sigama公司购买。顺铂从哈尔滨三联制药公司购入，紫杉醇为齐鲁制药公司生产。DMSO由美国Ameresco公司生产，低温高速离心机从德国引入，生化培养箱为SANYO公司生产，其他试剂为我国国内生产。

1.2 方法

1.2.1 培养细胞 所用细胞分别在DEME培养基中进行培养，其中含有10%小牛血清，将其放置在常温37℃环境下、5%浓度CO2培养箱中，实验周期选择细胞的对数生长期。当前临床上治疗宫颈癌的主要药物为紫杉醇和顺铂，具体的浓度按照临床常规剂量进行配制。分别取高10倍和低10倍浓度作为比较浓度。

1.2.2 分组方法 顺铂治疗情况下的三种细胞为实验组，紫杉醇不同浓度情况下的三种细胞变化情况为对照组。

1.2.3 MTT检测方法 首先，需要配制溶液，将0.5 g的MTT溶于磷酸缓冲液培养基中，容量为100 mL，细菌的去除使用0.22 μm滤膜过滤，置4℃环境下避光保存，配制和保存时都需要使用铝箔纸来避光。其次，检测细胞成长方法，对完全培养基的细胞浓度进行调整，浓度为5×103个/mL，每孔接入96孔培养板，再分别加入顺铂和紫杉醇，每组3孔，持續48 h。再加入100 μL/孔的DMSO，振摇均匀之后使用EXL-800型酶标仪测定。

1.2.4 Western blot测定方法 在细胞生长到90%左右时，需要使用冰预冷的PBS清洗2次。1000 rpm，时间为5 min，去除上清，再加入细胞裂解液，剂量为70 μL，沉淀，置冰上30 min，在4℃的环境下进行离心，10 min后收集上清。最后加入蛋白上样缓冲液，在100℃的环境下煮沸，时间持续5 min，在-20℃温度中保存。

1.3 统计学方法

本次研究所选用的统计学软件为SPSS 19.7，对研究中涉及的数据进行分析。计量资料用均数±标准差（x±s）表示，采用t检验；计数资料用%表示，采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度化疗药物对M-CSF活性影响比较

共进行3次实验，取平均值。当药物浓度在3 μg/mL时，HeLa-M细胞核与HeLa细胞和HeLa-C细胞相比，细胞活性差异显著（P<0.05）；当药物浓度在30 μg/mL时，HeLa-M细胞核与HeLa细胞和HeLa-C细胞相比，细胞活性差异显著（P<0.05）；而药物浓度在0.3 μg/mL，三种细胞活性无显著差异（P>0.05）。见表1。

2.2 Westen blot方法检测结果分析

结果显示，与HeLa细胞和HeLa-C细胞相比，HeLa-M细胞的Bcl-2表达明显偏高（HeLa、HeLa-C、HeLa-M灰度值分别为0.08±0.04、0.06±0.02、0.34±0.07）。而HeLa和HeLa-C细胞之间无明显差异，见封三图1。

3讨论

宫颈癌和乳腺癌均是比较常见的妇科恶性肿瘤，对妇女的健康产生严重的威胁[7]。近几年研究发现，在包含宫颈癌和乳腺癌在内的许多恶性肿瘤中巨噬细胞集落刺激因子水平会出现异常升高的现象，但是在其相应的良性肿瘤中却不容易被发现或处于正常现象，提示在血清的循环中，M-CSF很可能会成为这些肿瘤的分子标记物，与这些恶性肿瘤的发生存在密切的关系[8-10]。M-CSF简称为集落刺激因子，主要是由细胞信号转导网络中多种细胞所产生的细胞因子，此种细胞因子具有特异性[11]。根据相关研究证实，巨噬细胞集落刺激因子可能在许多肿瘤如宫颈癌等发生中扮演着十分重要的角色[12]。

M-CSF所发挥的作用十分重要，不管是正常情况还是肿瘤发生时，根据相关研究数据显示在不少恶性肿瘤中通常会出现M-CSF水平异常增高的现象，但是在良性肿瘤或者交界性肿瘤中却很难检测到[13]。近几年的研究更是表明M-CSF与恶性肿瘤的预后有着密切联系，有学者提出可以将M-CSF作为一些恶性肿瘤的标记物。在治疗肿瘤的过程中不少化疗药物均是通过诱导凋亡对细胞杀伤而实现治疗肿瘤的目的[14-15]。由于肿瘤耐药的靶分子、细胞凋亡相关基因可以与多药耐药其他途径一起介导多药耐药。

为了明确HeLa细胞核内M-CSF对化疗药物所产生的影响以及相关的作用机制，本研究结果发现，在治疗剂量以及高于治疗剂量的情况下，人宫颈癌HeLa细胞核内的M-CSF细胞与对照组细胞相比，对紫杉醇和顺铂的敏感性更低，对化疗药物的敏感性降低将会导致患者在临床治疗过程中出现耐药。本次研究分别以不同的化疗药物浓度进行研究，发现药物浓度在0.3 μg/mL时，各种细胞的活性最高，但细胞之间的活性无明显差异。另外，HeLa-M细胞的Bcl-2活性更高，Bcl-2是移植细胞凋亡增加耐药性的重要分子机制。细胞对于凋亡抑制作用的增强很可能与抗凋亡基因自身的变化密切相关，比如其出现过度表达或突变、缺乏等现象。与细胞凋亡相关的基因包含Bcl-2和Bcl-x1等。前者过度表达将会使肿瘤细胞凋亡得到有效抑制，对化疗药物杀伤肿瘤细胞的效果产生一定影响。Bcl-2家族是与细胞凋亡相关的基因家族，为同一个同源蛋白家族。当前越来越多的学者研究证实，Bcl-2可以使化疗的耐受性得到提高，还可提高肿瘤恶变的潜力和复发率。

综上所述，人宫颈癌HeLa细胞核中的M-CSF增高可以使细胞的药抗性提高，对HeLa细胞的消亡起到抑制作用。

[参考文献]

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（收稿日期：2017-04-09）