续断饮片、水煎剂、配方颗粒HPLC指纹图谱对比研究

高乐 范帅帅 王鑫国 田伟 陈钟 牛丽颖

摘要：目的 建立并比较续断饮片、水煎剂、配方颗粒的HPLC指纹图谱。方法 采用Wondasil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），以乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱，流速1.0 mL/min，检测波长212 nm，柱温30 ℃。结果 分别建立了12批续断饮片、水煎剂、配方颗粒的指纹图谱。12批续断配方颗粒HPLC指纹图谱的14个共有峰均能在水煎剂中得到追踪，有13个共有峰可在饮片中得到追踪，并指认出川续断皂苷Ⅵ、绿原酸2个成分。结论 建立的HPLC指纹图谱方法重复性好、稳定。续断饮片、水煎剂、配方颗粒所含化学成分组成基本相同。

关键词：指纹图谱；续断饮片；续断水煎剂；续断配方颗粒；川續断皂苷Ⅵ；绿原酸

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.07.019

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）07-0081-05

Abstract： Objective To establish and compare HPLC fingerprint chromatograms of Dipsaci Radix decoction pieces， aqueous decoction and formula granules. Methods The HPLC analysis was carried out in Wondasil C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5 ?m） with a mobile phase of acetonitrile-0.1% phosphoric acid by gradient elution. The flow rate was 1.0 mL/min； the detection wavelength was set at 212 nm； the column temperature was kept at 30 ℃. Results The fingerprint chromatograms from 12 batches of Dipsaci Radix decoction pieces， aqueous decoction and formula granules were established respectively. 14 common peaks in the fingerprint chromatogram in the formula granules could be tracked in the aqueous decoction， and 13 common peaks in the fingerprint chromatogram could be tracked in the decoction pieces. 2 chemical compounds were identified， such as asperosaponin Ⅵ and chlorogenic acid. Conclusion The method of HPLC fingerprint chromatograms is stable and with good repeatability. Dipsaci Radix decoction pieces， aqueous decoction and formula granules are basically the same chemical composition.

Key words： fingerprint chromatogram； Dipsaci Radix decoction pieces； Dipsaci Radix aqueous decoction； Dipsaci Radix formula granules； asperosaponin Ⅵ； chlorogenic acid

续断为川续断科植物川续断Dipsacus asper Wall. ex Henry的干燥根，《神农本草经》列为上品。续断性微温，味苦、辛，归肝、肾经，具有补肝肾、强筋骨、续折伤、止崩漏功效，用于肝肾不足、腰膝酸软、风湿痹痛、跌仆损伤、筋伤骨折、崩漏、胎漏等，是妇科和骨伤科常用中药，主要含有三萜皂苷、生物碱、

环烯醚萜类、挥发油类等成分[1-2]。

续断配方颗粒是以符合炮制规范的续断饮片为原料，经现代提取、浓缩、干燥、制粒等制剂工艺加工而成。配方颗粒突破了传统中药饮片煎煮的应用形式，具有免煎易服、作用迅速、成分完全、安全卫生、携带方便等优点，可成为替代传统中药饮片在临床上使用的新剂型，并越来越被广大患者所接受[3-4]。由于续断在传统方剂中多以汤剂入药，因此，有必要对续断饮片、水煎剂、配方颗粒三者之间化学成分组成进行比较。目前仅见关于续断药材及饮片的质量控制方法报道，以及对2个厂家配方颗粒中川续断皂苷Ⅵ含量进行比较的研究[5-8]。本试验采用HPLC分别建立续断饮片、水煎剂和配方颗粒的指纹图谱，并对三者HPLC指纹图谱进行比较研究，为续断配方颗粒的质量控制及临床应用研究提供参考。

1 仪器与试药

Ultimate 3000高效液相色谱仪（低压三元梯度泵，自动进样器，DAD检测器），美国赛默飞公司；变色龙色谱工作站，美国赛默飞公司；Wondasil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），日本岛津；TB-215D电子天平（十万分之一），德国赛多利斯。

川续断皂苷Ⅵ对照品（批号111685-201305，纯度91.3%），中国食品药品检定研究院；绿原酸对照品（批号20121117，纯度≥98.0%），上海源叶生物科技有限公司。12批续断配方颗粒（9批中试小样，编号01～09；3批中试成品，批号分别为15012711、15010411、15020811），神威药业集团有限公司；12批续断饮片（S1～S10，四川；S11、S12，云南），经河北省药品检验研究院孙宝惠鉴定为川续断科植物川续断Dipsacus asper Wall. ex Henry的干燥根；12批续断水煎剂（K1～K10，四川；K11、K12，云南），严格按照《医疗机构中药煎药室管理规范》药材煎煮方法相关要求制备。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Wondasil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脱（0～5 min，10%～13%A；5～15 min，13%～20% A；15～30 min，20%～25%A；30～38 min，25%～45%A；38～45 min，45%～85%A），流速1.0 mL/min，检测波长212 nm，柱温30 ℃，进样量10 ?L。

2.2 对照品溶液制备

精密称取川续断皂苷Ⅵ 5.15 mg、绿原酸5.50 mg分别置5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得川续断皂苷Ⅵ、绿原酸对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备

取12批續断配方颗粒适量，研细，取约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇25 mL，称定质量，超声提取（功率250 W，频率35 kHz）10 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得续断配方颗粒供试品溶液；取12批续断饮片，粉碎，过4号筛，各取约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，按配方颗粒供试品溶液制备方法制备续断饮片供试品溶液；称取上述12批续断饮片各10 g，加水浸过药面2～5 cm，浸泡30 min，煎煮，保持微沸60 min，倒出煎液，药渣加水再煎煮40 min，合并2次煎液，过滤，真空减压浓缩至浸膏，真空干燥，得干浸膏，按配方颗粒供试品溶液制备方法制备得续断水煎剂供试品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 精密称取同一批配方颗粒样品（批号15012711）约0.1 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，连续测定6次。以14号峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果RSD均小于3%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于制备后0、2、4、8、12、18 h注入液相色谱仪，以14号峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果RSD均小于3%，表明供试品溶液在18 h内稳定。

2.4.3 重复性试验 精密称取同一批配方颗粒样品（批号15012711）各约0.1 g，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，进样分析，以14号峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果RSD均小于3%，表明该方法重复性良好。

2.5 续断饮片、水煎剂、配方颗粒指纹图谱的建立

按“2.3”项下方法分别制备12批续断饮片、水煎剂、配方颗粒的供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》软件，分别对12批续断饮片、水煎剂、配方颗粒色谱图进行匹配，得到指纹图谱（见图1～图3）。其中，14个色谱峰为12批续断配方颗粒所共有，通过与对照品色谱图对照，指认出5号峰和14号峰分别为绿原酸和川续断皂苷Ⅵ。因14号峰在续断饮片、水煎剂、配方颗粒中分离度均较好且含量高、稳定，故选择该峰为参照峰（S），见图4。

2.6 相似度评价与比较研究

对续断饮片、水煎剂、配方颗粒HPLC对照指纹图谱进行比较，见图5。同时，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》软件，比较各12批续断饮片、水煎剂、配方颗粒图谱的相似度，结果见表1～表3。结果不同批续断饮片、水煎剂、配方颗粒之间相似度较高，均在0.9以上。续断饮片、水煎剂、配方颗粒HPLC指纹图谱的主要色谱峰基本一致，说明三者所含化学成分组成基本相同。

3 讨论

本试验以乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、甲醇-水作为流动相进行了梯度洗脱，结果显示，以甲醇-水为流动相梯度洗脱基线不稳，以乙腈-水为流动相梯度洗脱色谱峰分离度不高、峰形较差，而以乙腈-0.1%磷酸作为流动相进行梯度洗脱所得色谱峰的基线平稳、分离度良好并且峰形对称，故选择乙腈-0.1%磷酸作为流动相进行梯度洗脱。

供试品溶液制备时，本试验对提取溶剂（50%甲醇、70%甲醇、甲醇）、超声时间（10、20、30 min）等进行了研究，通过考察分离度、色谱峰形、出峰数目及各主要共有峰面积大小，最终确定了以甲醇超声10 min作为供试品溶液的制备方法。

本试验采用DAD检测器对续断配方颗粒供试品溶液进行紫外全波长扫描，结果显示，波长在212 nm与220 nm处大多数色谱峰具有较大吸收且色谱峰数量较多，而212 nm为参照峰川续断皂苷Ⅵ的最大吸收波长，故选择212 nm作为检测波长。

本试验采用HPLC对12批续断饮片、水煎剂、配方颗粒指纹图谱进行了比较研究，在方法学考察中，精密度、稳定性、重复性项下各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%，表明此方法准确、可靠、重复性良好。比较续断饮片、水煎剂、配方颗粒HPLC指纹图谱发现，在续断饮片中未发现3号色谱峰，然而此成分在续断水煎剂和配方颗粒中均存在，可能是续断饮片经一系列制剂工艺（如高温提取、浓缩等）后产生的，该成分是在制剂过程中其他成分受热相互作用产生还是由其他成分转化，有待进一步研究。另外，本试验与已发表的续断药材指纹图谱文献[9-10]相比，具有方法简便、分析时间较快、分离度良好、色谱峰清晰及峰形对称等优点，更能准确反映出续断饮片与水煎剂、配方颗粒之间化学组成的异同，为续断配方颗粒的临床应用研究提供参考。

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（收稿日期：2016-11-08）

（修回日期：2016-11-29；编辑：陈静）