分流型肺动脉高压模型大鼠存活素的变化

姚 健赵科研车 艳何 旭侯明晓徐 林*

（1 沈阳医学院附属第二医院心胸外科，辽宁 沈阳 110001；2 沈阳军区总医院心血管外科，辽宁 沈阳 110000）

分流型肺动脉高压模型大鼠存活素的变化

姚 健1赵科研2车 艳1何 旭1侯明晓2徐 林1*

（1 沈阳医学院附属第二医院心胸外科，辽宁 沈阳 110001；2 沈阳军区总医院心血管外科，辽宁 沈阳 110000）

目的观察凋亡抑制因子存活素在分流型肺动脉高压中的变化。方法20只wista大鼠随机分为实验组和对照组。采用左颈总动脉与左侧颈外静脉吻合法建立分流型肺动脉高压模型。右心导管法检测平均肺动脉压，测定右心室肥厚指数（右心室组织重量/左心室+室间隔组织重量），HE染色及免疫组化观察肺组织，ELISA法测定大鼠肺组织匀浆存活素和IL-6浓度。结果实验组大鼠平均肺动脉压、存活素、IL-6含量明显高于对照组，P＜0.05。实验组大鼠肺小动脉管腔缩窄，管壁增厚明显。血管内皮细胞水肿。肺小动脉管周大量炎性细胞浸润，以淋巴细胞为主。肺泡间隔增宽明显。存活素在实验对照组大鼠肺组织中表达强烈，发光细胞分布于肺泡间隔中和肺动脉平滑肌中。IL-6蓝染颗粒分布于肺泡间隔中和肺动脉平滑肌中。结论凋亡因子存活素在分流型肺动脉高压发病中起到重要作用，上游细胞因子IL-6参与了存活素的激活。

肺动脉高压；存活素；分流型

室间隔缺损、房间隔缺损等先天性心脏病存在大量体循环向肺循环血液分流，逐渐形成肺动脉高压，右心后负荷增加、右心重构，最终导致心力衰竭[1]。有关凋亡抑制因子存活素（survivin）在分流型肺动脉高压发生发展中的作用研究较少。本实验拟采用分流型肺动脉高压模型大鼠，观察存活素及其上游细胞因子白细胞介素-6（IL-6）的表达情况。

1 材料与方法

1.1 动物和试剂：6周龄健康雄性wistar大鼠20只（沈阳医学院实验动物中心提供），体质量150～200 g。乌拉坦（分析纯，美国Sigma公司），IL-6一抗（南京联基生物科技发展有限公司），存活素一抗（美国Abbiotec公司），二抗及DAB显色试剂盒（南京联基生物科技发展有限公司），IL-6ELISA试剂盒（南京联基生物科技发展有限公司），存活素ELISA试剂盒（美国R&D公司）。

1.2 方法

1.2.1 实验动物模型建立：医院伦理委员会同意本动物研究。大鼠按体质量随机分为对照组（n=10）和实验组（n=10）。对照组为正常大鼠，不做任何处理。实验组按文献[2]，采用左颈总动脉与左侧颈外静脉吻合法建立分流型肺动脉高压模型。两组大鼠置于同一实验室内饲养。3个月后再次麻醉后，检查以下指标。

1.2.2 大鼠肺动脉平均压（mPAP）：大鼠经腹腔内注射麻醉后，仰卧固定于鼠板上，经右侧颈外静脉置入微导管经右心至肺动脉，导管另一端连接压力传感器，观察显示屏，直至出现典型的肺动脉压力波形，稳定一段时间后压力波形经BL-420E系统记录并保存，拔出微导管。

1.2.3 右心室肥厚指数的测定：剖胸后采用放血法处死大鼠。取出大鼠心脏置于75%乙醇液中固定1周，心房组织剪除弃用。沿室间隔右室面边缘，分离出右心室（RV）组织、左心室+室间隔 （LV+S）组织，用滤纸吸干两部分组织水分后分别称重，两部分组织重量之比，即RV/（LV+S）代表右心室肥厚指数。

1.2.4 大鼠肺组织制备及观察：取大鼠左肺叶，75%乙醇固定，石蜡包埋后常规切片，行HE染色、存活素免疫荧光染色和IL-6免疫组化染色。每只大鼠选3张左肺组织切片，观察肺组织及血管变化情况以及存活素和IL-6表达情况。

1.2.5 ELISA法测定大鼠肺组织匀浆存活素和IL-6浓度：取右肺叶100 mg，剪碎肺组织后，加0.9%氯化钠溶液1.0 mL（溶液温度为4 ℃），用匀浆器制成肺组织匀浆，2 h内进行离心10 min（参数为4 ℃、3000 r/min），取上清液置于-70 ℃冰箱待检。用ELISA法测定大鼠肺组织匀浆中存活素和IL-6浓度，实验具体操作步骤按试剂盒说明书进行，每个样本设2个复孔。

表1 对照组和实验组指标的比较

表1 对照组和实验组指标的比较

注：*与对照组比较，P＜0.05。mPAP：平均肺动脉压。RV/（LV+S）：右心指数

mPAP(mm Hg)RV/(LV+S)%存活素(ng/mL)IL-6(pg/mL)对照组18.98±4.2025.6±1.22.43±1.981279.97±105.24实验组40.77±7.89*35.7±5.9*44.77±7.96*2048.69±288.69*

1.2.6 统计学方法：用SPSS18.0对数据进行统计分析，数据用表示。两组间差异比较采用t检验，α=0.05作为数据的检验水准，以P＜0.05为差异有显著性。

2 结 果

2.1 平均肺动脉压（mPAP）及右心指数RV/（LV+S）：与对照组比较，实验组大鼠mPAP显著升高，两组mPAP比较为：（18.98 ±4.20）mm Hg比（40.77±7.89）mm Hg，差异具有统计学意义（P＜0.05）；右心指数RV/（LV+S）亦较对照组升高，两组比较为（25.6±1.2）%比（35.7±5.9）%，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.2 肺组织学观察

2.2.1 肺组织HE染色观察：对照组：肺泡间隔正常，无增宽，未见肺气肿，无炎性细胞浸润，肺小动脉未见增厚，未见肺小动脉管腔狭窄。实验组：肺小动脉管腔缩窄，管壁增厚明显，可见玻璃样变。血管内皮细胞水肿。肺小动脉管周大量炎性细胞浸润，以淋巴细胞为主。肺泡间隔增宽明显。

2.2.2 存活素免疫荧光观察：对照组大鼠肺组织无存活素表达。存活素在实验对照组大鼠肺组织中表达强烈，发光细胞分布于肺泡间隔中和肺动脉平滑肌中。

2.2.3 IL-6免疫组化观察：对照组大鼠肺组织无IL-6表达，实验组有IL-6表达，肺泡间隔中和肺动脉平滑肌中可见蓝色颗粒。

2.3 肺组织均浆存活素和IL-6定量测量：实验组大鼠肺组织均浆中的存活素含量明显高于对照组，两组比较为（2.43±2.98）mm Hg比（44.77±7.96）mm Hg，P＜0.05，差异具有统计学意义；IL-6浓度同样高于对照组的浓度，两组IL-6浓度比较为（1279.97± 105.24）pg/mL比（2048.69±288.69）pg/mL，P＜0.05，差异具有统计学意义，见表1。

3 讨 论

先天性心脏病如动脉导管未闭、室间隔缺损、房间隔缺损等常伴有大量体循环向肺循环的血液分流[1]，肺血管床容积相对不足，肺血管扩张失代偿，导致肺动脉压力增高。本项研究中的肺动脉高压大鼠模型，采用左颈总动脉与左侧颈外静脉吻合，符合先天性心脏病左向右分流的血流动力学特点[3]。3个月后检测两组大鼠平均肺动脉压，实验组平均肺动脉压明显高于对照组平均肺动脉压。

目前，有关肺动脉高压的炎性反应和凋亡机制研究较多[4]。在野百合碱诱导PAH模型和低氧诱导PAH模型研究中发现，多种与炎症相关的细胞因子和凋亡抑制因子在肺动脉高压发生发展中发挥重要的作用[5-6]。多项研究表明凋亡抑制因子存活素在上述两种模型的肺动脉中表达都有显著增加[7-13]。本项目中，通过免疫荧光观察，存活素在对照组大鼠肺组织中无表达，而在实验组大鼠肺组织中表达强烈，肺泡间隔和肺动脉平滑肌中可见大量发光细胞；存活素上游细胞因子IL-6，在实验组大鼠肺组织中表达强烈，蓝染颗粒分布在肺泡间隔中和肺动脉平滑肌中。另外，通过ELISA定量测定肺组织均浆中存活素和IL-6的含量，实验组亦明显高于对照组，P＜0.05。表明在分流型肺动脉高压大鼠肺组织中同样存在存活素的表达。

另外，本项目实验组大鼠组织学观察可见在增厚的肺小动脉管壁周围，有大量以淋巴细胞为主的炎性细胞浸润，内皮细胞水肿，肺泡间隔明显增宽，表明分流型肺动脉高压大鼠肺组织内同样存在炎性细胞因子的释放。这可能是由于肺动脉压力增高造成血管内皮的损伤，诱发IL-6大量释放，由趋化作用导致炎性细胞聚集，进一步加重肺组织和血管内皮的炎性反应。作为IL-6下游因子，存活素不断增加，从而抑制血管内皮凋亡，肺动脉血管内皮不断重构，肺阻力不断增加，导致肺动脉压力升高。

因此，可以认为凋亡因子存活素在分流型肺动脉高压发病中起到重要作用，上游细胞因子IL-6参与了存活素的激活。有关IL-6-存活素这一信号通路如何转导尚需进一步研究。

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Changes of Survivin in Rat Model with Split - type Pulmonary Hypertension

YAO Jian1, ZHAO Ke-yan2, CHE Yan1, HE Xu1, HOU Ming-xiao2, XU Lin1*
(1 Department of Cardiothoracic Surgery, Second Affiliated Hospital of Shenyang Medical College, Shenyang 110001, China; 2 Department of Cardiovascular Surgery, Shenyang Military Region General Hospital, Shenyang 110000, China)

ObjectiveTo observe the changes of the apoptosis inhibitor survivin in shunt type pulmonary arterial hypertension rat model.Methods20 wista rats were randomly divided into experimental group and control group. Shunt type pulmonary hypertension model was established by anastomosis of left common carotid artery and the left external carotid vein. Mean pulmonary artery pressure be determinated by right cardiac catheterization. Right ventricular hypertrophy index (right ventricular weight/left ventricular & ventricular septal tissue weight), lung tissues were observed by HE staining and immunohistochemical staining, ELISA method for determination concentration of rat lung survivin and of IL-6.ResultsThe mean pulmonary artery pressure of experimental group rats, survivin, IL-6 content were significantly higher than the control group,P＜0.05. Experimental rat pulmonary arteriolar lumen narrowing, wall thickening and hyaline degeneration. Vascular endothelial cell edema. Pulmonary arteriole around full of inflammatory cells. Immunohistochemistrty showed expression of surviving and IL-6 obviously on the lung tissue in the experimental group.ConclusionSurvivin apoptosis factors played an important role in pulmonary hypertension incidence of shunt shunt type pulmonary arterial hypertension rat model, and upstream cytokine IL-6 was involved in the activation of survivin.

Pulmonary arterial hypertension; Survivin; Shunt

R543.2

B

1671-8194（2017）16-0001-02

沈阳医学院科技基金项目（编号：20122031）

*通讯作者:E-mail: xulin007@126.com