枸杞多糖对脑出血大鼠神经细胞凋亡及凝血酶受体-1表达的影响

邹有瑞，霍国进，王军成，吴 桥，沈 冰

·论 著·

枸杞多糖对脑出血大鼠神经细胞凋亡及凝血酶受体-1表达的影响

邹有瑞1，霍国进2，王军成3，吴 桥3，沈 冰1

目的 观察枸杞多糖(LBP)对大鼠脑出血(ICH)后神经细胞凋亡及凝血酶受体-1(PAR-1)表达的影响，并探讨其可能机制。方法 将72只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、LBP低剂量、中剂量、高剂量组(50、100、200 mg/kg)和尼莫地平组10 mg/kg。各给药组给予相应剂量药物灌胃，假手术组、模型组给予等体积生理盐水替代，1 次/d，共15 d。灌胃结束后，采用二次自体血注入法建立ICH模型；采用TUNEL法检测神经细胞凋亡，采用Western Blot、免疫组化、qRT-PCR，从不同水平探索LBP对ICH后脑组织PAR-1表达的影响。结果 模型组神经细胞凋亡率、PAR-1阳性率、PAR-1蛋白的表达及PAR-1 mRNA的表达较假手术组显著增加(P<0.05)，LBP各剂量组神经细胞凋亡率、PAR-1阳性率、PAR-1蛋白的表达、PAR-1 mRNA的表达较模型组均有不同程度的减低(P<0.05)。相关性分析显示，ICH后神经细胞凋亡率与PAR-1阳性率呈正相关性。结论 LBP能够抑制大鼠ICH引起的神经细胞凋亡，对ICH后脑组织具有保护作用，其机制可能与抑制PAR-1表达有关。

枸杞多糖；脑出血；细胞凋亡；凝血酶受体-1

脑出血(ICH)占急性脑血管病的20%～30%，其死亡率和病残率均较高，严重威胁着人类的健康[1]。ICH的病理生理机制复杂，ICH后继发性损伤是导致神经功能损伤的重要因素。最新研究表明，细胞凋亡在其中扮演着重要角色[2]。此外，凝血酶也在其中起着关键作用，它可以作用于脑组织内凝血酶受体-1(PAR-1)而发挥细胞毒性作用[3]。枸杞多糖(LBP) 是我国传统名贵中药枸杞的主要活性成分。最新研究证实，LBP具有减轻脑组织缺血再灌注损伤、降低氧自由基损伤、保护神经细胞、抑制神经元凋亡、改善学习记忆能力等功能[4-5]，这些研究主要集中在脑缺血、糖尿病等方面，但在ICH领域的相关研究罕见报道。本研究将观察LBP对ICH后神经细胞凋亡及PAR-1表达的影响，并探讨其可能机制。

1 资料与方法

1.1 实验动物：健康雄性SD大鼠72只，体重(200±30)g，由宁夏医科大学实验动物中心提供[合格证号：SCXK(宁)2500-001],符合实验动物伦理学要求。

1.2 主要试剂：LBP(银川泰丰生物科技有限公司，批号：G20140917,含量>32%)，全蛋白提取试剂盒，BCA蛋白含量检测试剂盒，兔抗鼠PAR-1 抗体(abcam 公司)，山羊抗兔荧光二抗(Proteintech公司)，免疫组化试剂盒，DAB显色试剂盒，TUNEL试剂盒(Roche公司)，Trizol(ambion公司),反转录试剂盒(Thermo 公司)，Maxima SYBR Green/Pox qPCR Master Mix(2×)(Thermo公司)。

1.3 主要仪器：Narishige脑立体定位仪，分析天平(Mettler Toledo)，酶标仪(Bio-Tek)，红外荧光扫描成像系统(Odyssey)，实时荧光定量PCR仪，低温离心机(Eppendorf)，石蜡切片机(Thermo),荧光显微镜(Olympus)，普通显微镜 (Olympus)。

1.4 方法

1.4.1 动物分组与给药：将健康雄性SD大鼠72只，随机分为假手术组、模型组、LBP低剂量组(50 mg/kg)、LBP中剂量组(100 mg/kg)、LBP高剂量组(200 mg/kg)、尼莫地平组(10 mg/kg)，每组12只。各大鼠给予相应剂量的药物连续灌胃，1 次/ d，连续灌胃15 d，假手术组与模型组给予等体积的生理盐水替代。

1.4.2 ICH模型的制备：选择二次注入法制作ICH模型[6]，大鼠用10%水合氯醛麻醉(38 mg/kg)，俯卧位固定于立体定位仪上。固定大鼠头部，调整高度使大鼠前后囟处于同一水平，以30号针头通过颅骨钻孔进入左侧基底节区(前囟后0.6 mm，左旁开3 mm，深度5.8 mm)。分2次缓慢注射大鼠自体血60 L(间隔时间2 min)，注射完毕后停针5 min，分2次缓慢退针(间隔时间2 min)。假手术组以同样的方法，注射60 μl生理盐水。手术结束，骨蜡封闭针孔，消毒缝合头皮，各组大鼠分笼饲养，正常饮食。

1.4.3 TUNEL技术检测细胞凋亡：造模后48 h，断头取脑，切取进针孔前与进针后脑组织，用于制作脑组织石蜡切片。利用TUNEL法检测细胞凋亡[7]，荧光显微镜下观察分析结果(蓝色荧光反应细胞总数、绿色荧光反应凋亡细胞数)，随机摄高倍镜下6个视野,分析凋亡细胞阳性率。

1.4.4 脑组织中PAR-1蛋白表达的检测：造模后48 h断头取脑，切取出血区脑组织100 mg，提取脑组织中全蛋白，所提取的全蛋白利用SDS-PAGE凝胶电泳进行分离，并转移至PVDF膜上。5%脱脂奶粉室温下封闭2 h后，加入兔抗鼠PAR-1抗体(1∶2 000 )4 ℃孵育过夜,抗GAPDH(1∶3 000)为内参对照4 ℃孵育过夜；TBST清洗后加入山羊抗兔荧光二抗(1∶5 000)室温下孵育1 h，TBST清洗后应用Odyssey红外荧光扫描成像系统对膜进行扫描，得到Western Blot条带图。利用Gelpro32图像分析软件获取各个条带的灰度值，以GAPDH作为内参进行比较分析，得出结论。

1.4.5 免疫组化检测脑组织中PAR-1蛋白的表达：取前面制作的脑组织石蜡切片，进行免疫组化染色。用DAB显色试剂盒检测抗原抗体反应，苏木素复染，脱水透明，中性树胶封片，显微镜下观察结果。随机选取6个视野拍照，分别计算各组PAR-1阳性细胞比例，统计分析得出结论。

1.4.6 qRT-PCR检测脑组织PAR-1 mRNA的表达：造模后48 h断头取脑，置于-80 ℃冰箱保存待测。利用Trizol提取大鼠脑组织总RNA，将所提取的RNA反转录为cDNA，采用qRT-PCR技术分别测定各组大鼠脑组织PAR-1mRNA的表达。PCR所用引物由生物公司设计，PAR-1引物序列：Forward primer：5’-GAGACAG CCAGAA TCTGA GAGG-3’；Reverse primer：5’- TAAGTAGA CTGCCCT GCCCT -3’；片段长度166 bp；内参对照GAPDH引物序列：Forward primer：5’-GACAT GCCGCCTG GAGAAAC-3’，Reverse primer：5’-AGCCCA GGATGCCCT TTAGT -3’，片段长度20 bp。PCR反应体系25 μl：Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix(2×) 12.5 L；模板cDNA；大鼠PAR-1/GAPDH上下游引物；无核酸酶的水补充至25 L。置于预冷的伯乐八连管中，混匀离心后上机进行热循环扩增。本研究以GAPDH为内参基因，用2-ΔΔCt法[8]进行相对定量分析，统计分析并制作箱式图。

2 结果

2.1 LBP对ICH后神经细胞凋亡的影响：假手术组于脑组织针道周围可见TUNEL阳性细胞，散在分布且数量少，其余各组TUNE阳性细胞明显增多。与假手术组比较模型组TUNEL阳性细胞率明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，LBP组与尼莫地平组TUNEL阳性细胞率明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠Tunel阳性细胞的比较(个，±s)

注：*与假手术组比较，P<0.05；#与模型组比较，P<0.05。

2.2 LBP对ICH后脑组织中PAR-1蛋白表达的影响：模型组大鼠脑组织中PAR-1蛋白表达量较假手术组显著增高(P<0.05)；与模型组比较，各LBP给药组PAR-1蛋白表达量均显著降低(P<0.05)，表明LBP可以降低ICH后脑组织中PAR-1蛋白的表达，见图1(目录后)。

2.3 免疫组化检测LBP对ICH后脑组织PAR-1表达的影响:PAR-1的表达主要分布于神经元及神经胶质细胞的细胞质中，模型组的PAR-1阳性细胞率显著高于假手术组(P<0.05)；与模型组比较，LBP中剂量组、高剂量组PAR-1阳性细胞率显著降低(P<0.05)，见图2(目录后)。

2.4 LBP对ICH后脑组织PAR-1 mRNA表达的影响：与假手术组比较，模型组PAR-1 mRNA的表达量显著增加(P<0.05)；与模型组比较，LBP组PAR-1 mRNA的表达量显著降低(P<0.05)，其中以LBP中剂量组下降最为明显，而LBP各剂量组之间比较差异无统计学意义，见图3(目录后)。

2.5 ICH后脑组织神经细胞凋亡率与PAR-1阳性细胞率的相关性分析：ICH后脑组织神经细胞凋亡率与PAR-1阳性细胞率呈正相关性，Pearson相关系数(r)为0.865(P<0.05)。

3 讨论

ICH的病理生理机制复杂，ICH后继发性损伤是导致神经功能损伤的重要因素，细胞凋亡在其中扮演着重要角色。目前，ICH缺乏循证医学确切有效的治疗手段，减轻出血后可出现继发性脑损伤，因此寻找切实有效的神经保护药物一直是ICH研究领域的重要课题。LBP是枸杞中提取的主要活性成分，它抑制神经细胞凋亡的作用已经在许多领域得到证实[4-5,9-10]，因此，猜想LBP也能抑制ICH引起的神经细胞凋亡。

本研究选择二次自体血注入法建立大鼠ICH模型，并在此基础上，利用TUNEL实验证实ICH能够引起神经细胞凋亡，且神经细胞凋亡多发生在出血区及其周围脑组织中，与其他学者实验结果相符[11]。该实验同时证实LBP能够抑制ICH引起的神经细胞凋亡，这种凋亡抑制作用在LBP中剂量组较为明显。LBP通过抑制ICH引起的神经细胞凋亡，进而保护ICH后脑组织。

ICH引起神经细胞调亡的机制尚不清楚，有很多因素能够诱发细胞凋亡，例如凝血酶、血红蛋白的分解、炎细胞的浸润等[12]。最新研究表明，PAR-1作为凝血酶受体家族中最主要的亚型，长期大量存在于ICH后血肿周围组织中，它具有神经细胞毒性作用[13-14]，参与凝血酶相关的诸多病理生理过程[15]，ICH后脑组织PAR-1表达的变化是凝血酶直接作用的结果[16]。因此，研究LBP对脑组织PAR-1表达的影响成了本实验的又一重要内容。

为了深入地了解LBP对ICH后神经细胞中PAR-1表达的影响，使用Western Blot、免疫组化、qRT-PCR等实验技术，从不同层面进行了探索，结果显示ICH后出血区及其周围脑组织中PAR-1蛋白的表达、PAR-1阳性细胞比例、PAR-1mRNA的表达显著增加，LBP能够在一定程度上抑制ICH引起的这种改变，表现为LBP各剂量组PAR-1蛋白的表达、PAR-1阳性细胞比例、PAR-1 mRNA的表达均较模型组显著减少，尤以中剂量LBP的抑制作用最强。作为补充，我们利用SPSS软件对脑组织神经细胞凋亡率与PAR-1阳性细胞率进行了相关性分析，证实ICH后神经细胞凋亡率与PAR-1阳性细胞率呈正相关性。

综上所述，ICH后出血区及其周围脑组织中可见神经细胞凋亡的发生与PAR-1表达的上调，而LBP不仅能够抑制大鼠ICH引起的神经细胞凋亡，而且能够抑制ICH后PAR-1的表达，进而对ICH后脑组织起到一定的保护作用，ICH后神经细胞凋亡率与PAR-1阳性细胞率呈正相关性关系。因此，LBP能够抑制ICH引起的神经细胞凋亡，而这种抑制作用似乎与PAR-1有着某种内在联系，其具体机制需要通过进一步的实验去探索。

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Effect of Lycium Barbarum Polysaccharides on the neuronal apoptosis and protease-activated receptor-1 expression after Intracerebral hemorrhage

ZOUYourui1,HUOGuojin2,WANGJuncheng3,WUQiao3,SHENBing1.

1.DepartmentofNeurosurgery,GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity，Yinchuan，750004,China;2.TheFirstHospitalofYulin,Yulin,719000,China;3.NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan,750004,China

SHEBin，Email:shenbing315@sina.com

Objective To observe the effect of Lycium Barbarum Polysaccharides (LBP) on the neuronal apoptosis and protease-activated receptor-1(PAR-1) expression after Intracerebral hemorrhage (ICH) in order to discuss its possible mechanism.Methods 72 SD rats were randomly divided into sham-operated group，model group，LBP low/moderate /high dose group，nimodipine group(n=12).Preoperatively 15th,LBP low /moderate /high group were given LBP 50,100,200 mgokg-1 by gavage，nimodipine group was given nimodipine 40 mg/kg by gavage，sham group and model group were given the same amount of saline,which were given for 15 days,1 time per day,.After gavage,using autologous blood to inject caudate nucleus in order to build rat ICH model.The neuronal apoptosis was assessed by TUNEL assay.The impact of LBP on the PAR-1 expression was detected by Western Blot,immunohistochemistry and RT-PCR techniques.Results Neuronal apoptosis rate,PAR-1 positive rate,PAR-1 protein and PAR-1mRNA expression in the ICH group were significantly higher than sham-operated group(P<0.05).Neuronal apoptosis rate,PAR-1 positive rate，PAR-1 protein and PAR-1 mRNA expression in the each dose group of LBP were significantly lower than the ICH group(P<0.05).Correlation analysis confirmed a positive correlation between neuronal apoptosis rate and PAR-1 positive rate after ICH.Conclusion LBP can not only reduce the neuronal apoptosis,but also inhibit the expression of PAR-1 after ICH.It has a protective role in cerebral after ICH.

Lyciumbarbarumpolysaccharides;Intracerebralhemorrhage;Apoptosis;Protease-activatedreceptor-1

10.13621/j.1001-5949.2017.06.0481

宁夏科技支撑计划项目(2013ZY8160)

1.宁夏医科大学总医院神经外科，宁夏 银川 750004 2.陕西省榆林市第一人民医院，陕西 榆林 719000 3.宁夏医科大学，宁夏 银川 750004

邹有瑞(1985-)，男，蒙古族，内蒙古籍，医学硕士，主治医师，从事神经外科研究方向。

沈冰，Email:shenbing315@sina.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170614.1314.002.html

R285

A

2016-12-14 [责任编辑]王凯荣