虫草素对高糖介导大鼠肾小管上皮细胞p38MAPK通路及TGF—β1表达的影响

梁泽智++黄洁平

[摘要]目的 探讨虫草素（Cordycepin）对高糖介导大鼠肾小管上皮细胞p38MAPK通路及TGF-β1表达的影响。方法 体外培养大鼠近端肾小管上皮细胞株（NRK52E细胞株），分为正常对照组（NG组）、高糖组（HG组）、高糖+虫草素组（HG+C组）。应用定量RT-PCR测定NRK52E p38MAPK及TGF-β1 mRNA的表达；采用Western印迹方法检测不同时间点p-p38MAPK、TGF-β1蛋白的表达水平。结果 与NG组比较，HG组NRK52E细胞的p38MAPK、TGF-β1 mRNA表达增多（P<0.01）；p-p38MAPK蛋白、TGF-β1蛋白表达与mRNA表达趋势一致（P<0.05）；而虫草素可以显著抑制高糖介导的NRK52E细胞p38MAPK的活化及TGF-β1的表达。结论 虫草素可以抑制高糖介导大鼠肾小管上皮细胞p38MAPK活化及TGF-β1表达。

[关键词]p38MAPK；虫草素；TGF-β1；葡萄糖

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）06（b）-0004-04

[Abstract]Objective To investigate effect of cordycepin on p38MAPK pathway and TGF-β1 express in NRK52E cells stimulated by high glucose.Methods NRK52E cells were cultured in the mediun with normal glucose concentration （group NG），high glucose concentration （group HG） and high glucose concentration+cordycepin （group HG+C）.The expression of p38MAPK and TGF-β1 mRNA was measured by quantitative RT-PCR；the expression level of p-p38MAPK and TGF-β1 protein was detected by Western blot.Results The p38MAPK and TGF-β1 mRNA in NRK52E cells were highly expressed in group HG compared with group NG （P<0.01）；the tendency of p-p38MAPK and TGF-β1 protein expressed was accordance with expression of mRNA.However，cordycepin can significantly inhibit the activation of p38MAPK pathway and TGF-β1 express in NRK52E cells stimulated by high glucose.Conclusion Cordycepin can significantly inhibit the activation of p38MAPK pathway and TGF-β1 express in NRK52E cells stimulated by high glucose.

[Key words]P38MAPK；Cordycepin；TGF-β1；Glucose

糖尿病腎病（diabetc nephropathy，DN）是导致终末期肾病（end-stage renal disease，ESRD）最常见的原因之一[1]，小管间质纤维化是其重要的临床表现[2]。多种因素参与了糖尿病肾病的发生及发展[3]，包括高糖、细胞通路的激活[4]等。p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）是MAPK家族的一个亚族，可被高糖等因素激活，激活后可通过上调TGF-β/Smad等多条信号转导途径[5]最终导致了肾小球的纤维化[6]。TGF-β1是公认的致纤维化因子，在肾纤维化过程中发挥重要作用。研究发现，TGF-β1和p38MAPK存在相互串话[7]，共同导致了肾脏的纤维化。虫草素是中国名贵草药冬虫夏草的主要成分之一，在肾脏中具有重要保护作用，但是机制尚未明确，本实验通过体外培养NRK52E细胞，观察虫草素对高糖介导的NRK52E细胞p38MAPK通路及TGF-β1表达的影响，探讨虫草素对肾脏保护作用的机制。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂 NRK52E细胞（肾小管上皮细胞，中山大学余学清教授惠赠），虫草素（Sigma公司，货号：C3394-10MG），葡萄糖（Sigma公司，货号：G7021-100G），TRizol试剂（Invitrogen公司，货号：15596026），逆转录试剂盒（SuperScriptRⅢ First-Strand Synthesis System for RT-PCR kits，Invitrogen公司），PCR扩增试剂盒（SYBRRSelect Master Mix，Invitrogen公司），胎牛血清（美国Gibco BRL，货号：16000-044），兔抗大鼠p-p38MAPK多克隆抗体（英国New England Biolabs），小鼠抗大鼠TGF-β1单克隆抗体（美国Abcam）等。

1.1.2仪器设备 恒温CO2细胞培养箱：美国Thermo公司；倒置荧光显微镜：美国AXJOVERT公司；PCR扩增仪PCT-200：美国Thermo公司；荧光定量PCR仪：Applied Biosystems；超微量分光光度计 NANODROP-2000：美国Thermo公司；显微镜及成像系统：OLYMPUS BX51；凝胶成像系统：法国BIO-UISON100；超声波细胞粉碎仪：SCIENTZ公司；定量酶标仪：美国MRX2；电泳仪：美国Bio-RAD公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养及分组 用低糖DEME完全培养基（含10%胎牛血清）培养细胞，待细胞贴壁60%～80%，改用无血清培养基进行同步培养，将细胞按照设计进行分组并加入不同浓度葡萄糖：正常对照组（5.5 mmol/L）、高糖组（30 mmol/L）、高糖+虫草素组（30 mmol/L，虫草素浓度10 μg/ml），高糖+虫草素组使用虫草素进行预先干预2 h。

1.2.2 qRT-PCR 待细胞培养足够时间，收集细胞，提取细胞的总RNA。然后对RNA进行OD值及浓度测定。取1 μg的总RNA按照试剂盒说明书的方法进行合成cDNA，然后再对逆转录产物进行扩增。采用primer 5.0软件设计目的基因引物序列，由北京华大基因公司合成，所得引物用DEPC水稀释后放于-20℃备用，各基因引物序列见表1。反应体系：SYBR 10 μl；Forward 0.16 μl；Reverse 0.16 μl；ddH2O 4.68 μl；cDNA 5 μl；反应条件及步骤：①预变性：采取95℃进行2 min；②变性：95℃的温度进行15 s；③退火：58℃进行30 s；④延伸：72℃延伸30 s；⑤循环：总共经过40个循环，再充分延伸10 min。将所合成的指标（p38MAPK、TGF-β1）与内参（GAPDH）的Ct值采取取对数的方式进行比较，其比值表示待测指标的mRNA的相对表达量。

1.2.3 Western blot 按设计分组培养细胞并加入不同的刺激，15 min、30 min、60 min、12 h、24 h、48 h后，收集细胞，提取细胞总蛋白，进行超声破碎，接着采用BCA定量法对蛋白进行测定其浓度。采用8% SDS-PAGE分离胶上样，电泳时先采用80 V，待样品蛋白到达分离胶后，改成120 V，继之在340 mA下转膜2.5～3 h，使用5%脱脂牛奶封闭2 h，一抗采用浓度为：（p-p38MAPK，1∶3000；TGF-β1，1∶2000）过夜，使用脱脂牛奶洗涤加二抗（1∶5000～1∶10 000），暗室曝光、显影，最后进行灰度分析。

1.3统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1不同时间点NRK52E细胞的p38MAPK mRNA表达情况

高糖刺激后，不同时间点的p38MAPK mRNA的表达明显升高，并且在15 min、24 h两个时间段出现高峰；高糖+虫草素组的p38MAPK mRNA表达较高糖组明显降低，较正常对照组升高（P<0.01）（图1）。

2.2不同时间点NRK52E細胞的TGF-β1 mRNA表达情况

在高糖的刺激下，不同时间点的TGF-β1 mRNA的表达明显升高，并且在呈时间依赖性增加；高糖+虫草素组的TGF-β1 mRNA较高糖组明显降低，较正常对照组升高（P<0.01）（图2）。

2.3不同时间点p38MAPK蛋白的表达情况

在高糖的刺激下，不同时间点的p-p38MAPK蛋白的表达明显升高，并且在15 min、24 h两个时间段出现高峰；高糖+虫草素组的p-p38MAPK蛋白表达较高糖组明显降低，较正常对照组升高（P<0.01）（图3）。

2.4不同时间点NRK52E细胞的TGF-β1蛋白表达情况

在高糖的刺激下，不同时间点的TGF-β1蛋白的表达呈时间依赖性地升高；高糖+虫草素组的TGF-β1蛋白表达较高糖组明显降低，较正常对照组明显升高（P<0.01）（图4）。

3讨论

糖尿病肾病是以肾小球系膜细胞增殖、肥大以及细胞外基质过度积聚，最终导致肾脏纤维化。多种因素及细胞通路参与糖尿病肾病肾脏纤维化的发生及发展，包括TGF-β/Smad通路、p38MAPK通路[8]等。

TGF-β是公认的导致肾脏细胞外基质（ECM）沉积和纤维化的最重要的因子，在糖尿病肾病患者的发展中起着核心作用[9]。Zeisberg等[10]研究发现，TGF-β1刺激后，人近端肾小管上皮细胞失去上皮细胞表型E-cadherin，获得了肌成纤维细胞的表型α-SMA，并导致了细胞外基质成分产生增加。有研究表明，在糖尿病肾病中，TGF-β可以通过激活TGF-β依赖的Smad信号通路，也可以激活非TGF-β依赖的信号通路，如p38MAPK，最终促进ECM的合成、EMT的发生[11-12]，最终引发肾间质纤维化。

p38MAPK是各种细胞外信号刺激细胞内信号传递的共同通路，它可以被多种因素激活。Lv等[13]发现，高糖能够导致肾小管上皮细胞p38MAPK通路的激活，参与了EMT的发生；在糖尿病肾病中，p38MAPK 的活化可以直接调节α-SMA蛋白的合成[14]，同时间接的活化Smad通路，参与了TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞EMT的发生[15]。Tzeng等[16]用乙醇提取的金银花可以抑制p38 MAPK的活化延缓了STZ诱导的糖尿病肾病的发生及发展。

冬虫夏草是我国传统的名贵中草药，具有“益肺肾﹑补精髓”之功效。虫草素是从其分离出来的单体，是一种核苷类似物。周巧玲等[17-18]的研究发现，冬虫夏草可下调糖尿病肾病肾组织TGF-β1、CTGF及Ⅳ型胶原的表达，减轻糖尿病肾病肾纤维化。除此外虫草素还可以抑制嘌呤合成，诱导凋亡，引起细胞周期阻滞、减少炎症介质释放等药理作用[19-20]。

本实验研究显示，高糖介导下，不同时间点的p38MAPK、TGF-β1 mRNA及蛋白表达均明显增高，虫草素干预后，高糖介导下的p38MAPK、TGF-β1 mRNA及其蛋白高表达均明显下调，提示虫草素可以抑制高糖介导大鼠肾小管上皮细胞p38MAPK通路活化及TGF-β1表达。因此，本研究推测，虫草素可能通过抑制p38MAPK通路活化从而下调TGF-β/Smad信号转导，减轻糖尿病肾病肾脏纤维化。本研究组下一步将检测虫草素对p38MAPK、TGF-β/Smad通路活化后下游相关蛋白的表达的影响，明确虫草素对糖尿病肾病防治机制，为糖尿病肾病的治疗提供新的认识和理论依据。

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（收稿日期：2017-04-25 本文编辑：任 念）