跑台运动对阿霉素联合醋酸戈舍瑞林诱导骨质疏松大鼠骨密度和骨代谢的影响

苏红燕 马涛

1. 山东体育学院, 山东 济南 250102 2. 齐鲁师范学院，山东 济南 250200

多柔比星[商品名：阿霉素(doxorubicin，DOX)]是一种被用作有效治疗各种癌症的蒽环类抗生素。虽然应用DOX治疗癌症会产生众多的副作用和不良反应，但临床上最引起人们关注的是DOX可造成卵巢的损害，从而导致不育，并且这种损害是不可逆的[1,2]。如果在癌症患者DOX给药之前，先给予患者促性腺激素释放激素(gonadtropin releasing hormone，GnRH)类似物醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate，GA)等药物，则可以最大限度地降低DOX引起的卵巢损害。GA通过抑制卵巢功能，并进而降低卵巢对DOX引起的伤害的易感性[3,4]。 终止DOX治疗后，GA给药也应当及时终止，之后卵巢功能即可恢复到正常状态[5]。

对于接受GA或者DOX治疗的患者来说，一个重要的威胁是GA和DOX均可导致骨质流失，并进而造成骨质疏松症的发生。既然单独使用GA或DOX均可对骨代谢产生不良的影响[6,7]，那么联合使用GA和DOX是否有可能比单独使用GA或DOX对骨代谢产生更大的负面影响呢？然而，到目前为止，没有查到关于GA和DOX联合作用对骨代谢影响的报道，因此，本研究的目的之一在于研究GA和DOX联合作用对骨代谢的影响是否显著大于GA或DOX单独作用对骨代谢的影响，本研究的目的之二在于研究跑台运动对DOX联合GA诱导的大鼠骨质流失的防治效果。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

8周龄雌性SD大鼠64只，体重218.07±9.26 g，购于上海斯莱克实验动物有限公司[SCXK(沪)2007-0005]。在标准的实验室环境下分笼饲养，环境温度为22±1 ℃，光照遵循12 h:12 h明暗周期，每日提供足够食物，自由饮水。动物购回适应本实验室环境和饮食1周后，被随机分为8组，每组8只：安静对照组(SED)、DOX干预组(SED+DOX)、GA干预组(SED+GA)、DOX和GA联合干预组(SED+DOX+GA)、跑台运动对照组(EX)、跑台运动结合DOX干预组(EX+DOX)、跑台运动结合GA干预组(EX+GA)、跑台运动结合DOX和GA联合干预组(EX+DOX+GA)。

1.2 药物干预方案

GA的给药方式为在跑台训练第1天和第29天分别给大鼠颈背部皮下注射诺雷得(GA缓释植入剂，英国阿斯利康制药公司)1支(3.6 mg/支)，因为据Furr报道[8]一次性注射3.6 mg的诺雷得可以维持大鼠雌激素分泌降低持续28 d左右，其余组别大鼠同一日颈背部皮下注射等量的可生物降解的硅胶作为对照。DOX的给药方式[9]为在跑台训练第15天开始，每天给予大鼠腹腔注射1.5 mg/kg体重的2 mg / mL的盐酸阿霉素(上海生工)，共连续注射10 d，其余组别大鼠同时间周期内每日注射等量的生理盐水作为对照。

1.3 运动方案

对于EX组、EX +DOX组、EX +GA组以及EX +DOX+GA组大鼠，在分组后的第二天开始进行为期8周的跑台训练，每周训练6 d，每天训练30 min，跑速为30 m/min。

1.4 取材

8周的运动和药物干预后，于跑台训练组大鼠最后一次训练结束后24 h，断颈椎处死所有大鼠，在断颈椎后迅速心脏取血[10]，3 000 r/min 4 ℃离心20 min，分离血清，-20 ℃ 冰箱内保存待测血钙(Ca2+)、血清碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(BGP)和抗酒石酸酸性磷酸酶5b (TRACP5b)等血清骨代谢指标。分离大鼠左侧股骨，用浸透生理盐水的纱布包好，于-20 ℃ 冰箱内保存待测BMD。

1.5 测试方法

邻甲酚酞络合酮终点比色法(南京建成试剂盒)测定血钙(Ca2+)，MODULAR 全自动生化分析仪(日本)(美国Roche公司试剂盒)测定血清碱性磷酸酶(ALP)；骨钙素(BGP)和抗酒石酸酸性磷酸酶5b (TRACP5b)的测定采用酶免法(美国ADL 公司试剂盒，美国MUL2TISCAN MK3酶标仪)。

股骨骨密度的测定采用pDEXA 型双能X 线骨密度仪(美国Norland 公司)测定，将股骨从-20 ℃冰箱取出，室温自然解冻12 h，双能X 线骨密度仪扫描整个股骨，测定其骨密度。

1.6 统计学处理

各检测结果以平均数±标准差表示，用SPSS11.0软件对组间差异进行方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义，以P<0.01为差异具有显著统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠股骨骨密度

由图1可知，首先，DOX与GA的单独或联合给药均显著降低了各组大鼠的骨密度，即SED+DOX组、SED+GA组和SED+DOX+GA组大鼠股骨骨密度均显著低于其对应的非药物干预组SED组(P< 0. 01)；同样，EX+DOX组、EX+GA组和EX+DOX+GA组大鼠股骨骨密度均显著低于其对应的非药物干预组EX组(P< 0. 01)。其次，DOX和GA联合干预对于大鼠骨质疏松的影响显著大于DOX或GA单独给药的影响，即SED+DOX+GA大鼠股骨骨密度显著低于SED+DOX组和SED+GA组(P< 0. 01)；同样，EX+DOX+GA组大鼠股骨骨密度显著低于EX+DOX组和EX+GA组(P< 0. 01)。再次，跑台运动显著降低了DOX与GA的单独或联合给药造成的骨质流失，即EX+DOX组、EX+GA组和EX+DOX+GA组股骨骨密度均显著高于其对应的安静组SED+DOX组、SED+GA组和SED+DOX+GA组(P< 0. 05或P < 0. 01)。

图1 各组大鼠股骨骨密度比较注：药物干预组与其对应的非药物干预对照组相比较，@@P<0. 01；药物联合干预组与其对应的药物单独干预组相比较，**P<0. 01；跑台运动组与其对应的安静组相比较，#P<0. 05或##P<0. 01Fig.1 Comparison of BMD of the femur between each group

2.2 各组大鼠骨代谢指标

由表1可知，首先，DOX与GA的单独或联合给药均使大鼠的骨形成指标ALP和BGP水平显著降低而骨吸收指标Ca2+和TRACP5b水平显著升高，即SED+DOX组、SED+GA组和SED+DOX+GA大鼠的血清骨形成指标ALP和BGP水平显著低于其相对应的非药物干预组SED组(P<0. 01)，而SED+DOX组、SED+GA组和SED+DOX+GA大鼠的血清骨吸收指标Ca2+和TRACP5b水平显著高于其相对应的非药物干预组SED组(P<0. 01)；同样， EX+DOX组、EX+GA组和EX+DOX+GA组大鼠血清骨形成指标ALP和BGP水平显著低于其相对应的非药物干预组EX组(P<0. 05或P<0. 01)，而EX+DOX组、EX+GA组和EX+DOX+GA组大鼠血清骨吸收指标Ca2+和TRACP5b水平显著高于其相对应的非药物干预组EX组(P<0. 01)。其次，DOX和GA联合干预对于大鼠骨代谢指标的影响显著大于DOX或GA单独给药的影响，即SED+DOX+GA组大鼠血清骨形成指标ALP和BGP水平显著低于SED+DOX组和SED+GA组(P<0. 01)，而SED+DOX+GA组大鼠血清骨吸收指标Ca2+和TRACP5b水平显著高于SED+DOX组和SED+GA组(P<0. 01)；同样， EX+DOX+GA组大鼠血清骨形成指标ALP和BGP水平显著低于EX+DOX组和EX+GA组(P<0.01)，而EX+DOX+GA组大鼠血清骨吸收指标Ca2+和TRACP5b水平显著高于EX+DOX组和EX+GA组(P<0.01)。再次，跑台运动显著降低了DOX与GA单独或联合给药对大鼠骨代谢造成的影响，即EX+DOX组、EX+GA组和EX+DOX+GA组大鼠血清骨形成指标ALP和BGP水平显著高于其相对应的安静组SED+DOX组、SED+GA组和SED+DOX+GA组(P<0. 05或P<0. 01)，而EX+DOX组、EX+GA组和EX+DOX+GA组大鼠血清骨吸收指标Ca2+和TRACP5b水平显著低于其相对应的安静组SED+DOX组、SED+GA组和SED+DOX+GA组(P<0. 05或P<0. 01)。

3 讨论

3.1 阿霉素与醋酸戈舍瑞林联合作用对大鼠骨密度和骨代谢的影响

DOX是临床上广泛应用的治疗肿瘤的药物之一，通过嵌入DNA，抑制拓扑异构酶II和解旋酶的作用，产生活性氧而有效抑制各种恶性细胞的生长和增殖[11]。但是，DOX也是已知的可使骨量减少的药物之一，DOX给药可以显著降低骨矿含量和骨密度[12]。本研究的结果也进一步证实，与其相对应的非药物干预组SED组和EX组相比，SED+DOX组和EX+DOX组大鼠骨密度显著降低、血清骨形成指标ALP和BGP水平显著降低而骨吸收指标Ca2+和TRACP5b水平显著升高，这说明DOX可造成大鼠骨形成作用减弱而骨吸收作用增强，加速骨质的流失，并最终导致骨密度的下降。DOX毒性众所周知的机制是其与线粒体相互作用导致的活性氧的增加，从而造成细胞的损伤，所以DOX与骨细胞线粒体相互作用产生的自由基对骨细胞造成伤害，这极有可能是DOX造成骨质疏松的重要原因之一。此外，DOX可通过对于卵巢的损伤，减少雌激素的分泌，并进而对骨代谢造成不良影响，这也是DOX造成骨代谢失平衡的原因之一[13]。

表1 各组大鼠血清骨代谢指标的比较Table 1 Comparison of serum bone metabolic markers between each

注：药物干预组与其对应的非药物干预对照组相比较，@P<0.05或@@P<0.01)；药物联合干预组与其对应的药物单独干预组相比较，**P<0. 01；跑台运动组与其对应的安静组相比较，#P<0. 05或##P<0. 01

在应用DOX治疗各种癌症时，DOX对于患者卵巢的损伤也是目前临床上所面临的一个主要问题。研究显示，在应用DOX治疗各种癌症时，DOX则会首先蓄积在位于卵巢中心的基质细胞，随后逐渐向卵巢周边区域积累，并最终导致卵巢细胞的凋亡[14]。在癌症患者的临床治疗中，为了抑制卵巢的功能从而避免DOX对于卵巢的损害，在DOX给药之前和给药期间，经常采用联合GA给药的措施。

然而，GA在抑制卵巢功能的同时也大大降低了雌激素的分泌，鉴于雌激素对于骨代谢的重要作用，GA的给药将有可能进一步加重DOX对骨代谢造成的不利影响。研究显示，接受GA治疗的患者雌激素水平则会下降到绝经后水平[15]，而雌激素水平的迅速下降对于骨代谢的负面影响已是众所周知，绝经后妇女由于雌激素的迅速下降而易患骨质疏松症已是不争的事实[16]。Hydock等[17]的研究表明，8周的GA给药可以显著降低雌性大鼠胫骨近端松质骨的骨量。本研究的结果也显示，与其相对应的非药物干预组SED组合EX组相比，SED+GA组和EX+GA组大鼠骨密度显著降低、血清骨形成指标ALP和BGP水平显著降低而骨吸收指标Ca2+和TRACP5b水平显著升高，进一步证实了GA通过破坏大鼠骨代谢的动态平衡，造成大鼠骨质的流失。

关于GA和DOX联合用药对骨代谢影响的研究目前在国内外尚未见报道，本研究显示，联合GA和DOX给药比单独的GA或DOX给药可造成更严重的骨量丢失。与SED+DOX组和SED+GA组相比，SED+DOX+GA组大鼠骨密度显著降低、血清骨形成指标ALP和BGP水平显著降低而骨吸收指标Ca2+和TRACP5b水平显著升高，同样与EX+DOX组和EX+GA组相比，EX+DOX+GA组大鼠骨密度显著降低、血清骨形成指标ALP和BGP水平显著降低而骨吸收指标Ca2+和TRACP5b水平显著升高。这说明，临床上在应用DOX治疗各种癌症时，经常采用联合GA的给药，虽然可以显著降低DOX对于卵巢的损伤，但同时也加重了DOX对于骨组织的损伤。这两种药物对骨代谢的累加效应，可能是通过其对成骨细胞和破骨细胞的作用实现的。研究显示，不仅雌激素能够调节成骨细胞和破骨细胞的生成和细胞凋亡[18,19]，而且DOX也可以以剂量依赖性的降低成骨细胞活性[20]和增加破骨细胞的活性[21]。而GA对骨代谢造成影响的原因可能主要是由于其导致的雌激素分泌减少与DOX共同作用于成骨细胞和破骨细胞，干扰正常的骨转换过程，从而导致骨质的加速流失，这将是临床上接受GA联合DOX治疗方案的癌症患者和医学工作者们所面临的一个重要的问题。

3.2 跑台运动对阿霉素联合醋酸戈舍瑞林诱导骨质疏松大鼠骨密度和骨代谢的影响

DOX和GA单独或联合用药导致的骨质流失的问题已经成为困扰临床上乳腺癌等癌症患者接受治疗的重要问题之一[22]，而减少这种骨质流失的干预方法也已经引起了科研人员的广泛关注[23]。近年来，人们也一直在研究关于癌症治疗相关的骨量丢失的干预措施，包括使用双膦酸盐，维生素D和钙补剂等[24]。此外，运动能够对骨代谢产生积极的影响，运动时肌肉的收缩以及运动时来自地面的反作用力，都能够对骨组织产生相应的力学刺激，从而有利于骨量的积累[25]。运动也是近年来已被提出的作为保护由癌症治疗引起的骨量丢失的干预措施之一[26]。

研究显示，单纯的使用运动干预并不足以抵消雌激素缺乏所造成的骨损伤[27]，因此，运动联合应用其它的骨保护干预措施来减少GA诱导的骨量丢失应该是必要的，例如运动联合双膦酸盐[28]和维生素D3[29]的补充等。有研究显示，自愿转轮运动对GA诱导的雌性大鼠胫骨松质骨骨质疏松几乎没有保护作用，并且作者推测自愿转轮运动缺乏对骨组织的保护作用是因为其零星的运动时间以及这种运动方式对骨组织产生的机械应力较小[30]。此外，也有研究表明，自愿转轮运动对DOX诱导的生长期大鼠的骨质流失也同样没有保护作用[31]。鉴于以上两项研究结果，我们有必要研究其他能够控制运动强度和时间，而且能够对骨组织产生较强机械刺激的运动方式对于GA和DOX诱导的骨质疏松的保护效果。已经有研究提出具有较强力学刺激的运动方式可作为减少这种骨质流失的重要方法之一[32,33]。本研究结果显示，跑台运动可以显著降低DOX与GA的单独或联合给药对大鼠骨密度和骨代谢造成的负面影响，与其相对应的安静组SED+DOX组、SED+GA组和SED+DOX+GA组相比，EX+DOX组、EX+GA组和EX+DOX+GA组大鼠骨密度显著升高、血清骨形成指标ALP和BGP水平显著升高而骨吸收指标Ca2+和TRACP5b水平显著降低，证明了跑台运动对于DOX联合GA诱导骨质疏松具有较好的防治效果。

在以往的临床研究中，尽管运动已被证明是一种减少化疗引起的骨量丢失的有效方法[34,35]，但以往的临床研究中患者接受的抗癌药物有些是含有DOX和GA的，有些则不含DOX和GA，虽然接受化疗的癌症患者仍然比健康对照组患骨质疏松症的几率显著提高[34]，但也很难就此推测癌症患者的骨量丢失是否是由于抗癌药物DOX和GA引起的。此外，由于癌症患者患病后体力较差，会出现患病后长期静卧缺乏运动的生活方式，即其骨质疏松症也有可能是由于患病后长期静卧缺乏运动导致的，或者可能是抗癌药物和缺乏运动共同作用的结果，故临床的统计数据很难避开这些因素的干扰。在本研究中，选取健康大鼠作为研究对象，在其药物干预期间，各组大鼠在饲养笼中的日常活动量几乎没有差别，这就避免了临床上癌症患者久卧少运动的生活状态对于骨代谢的负面影响，DOX和GA药物干预组与非药物干预组大鼠骨密度及骨代谢的差异就可以认为是单纯的药物作用的效果。同样，在本研究中，跑台运动对于DOX和GA诱导骨质疏松的防治效果也避开了临床上癌症病人久卧少运动的生活状态对于实验数据的干扰。

4 结论

1．DOX和GA单独或联合作用均可造成大鼠骨代谢的失平衡和骨密度的下降，导致大鼠骨质疏松症的发生。

2．DOX和GA联合作用诱导大鼠骨质疏松的程度显著大于DOX或GA单独作用的结果。

3．跑台运动可以有效降低DOX和GA单独或联合作用诱导的骨密度下降和骨代谢失平衡，降低大鼠骨质疏松的程度。