Rab7基因沉默对巨噬细胞中R848激活的细胞因子及MAPK信号通路影响①

邹 凯 云小乐 康鸿斌 王 雪 张晓慧 谢基明 王玉珍

(内蒙古农业大学生命科学学院，呼和浩特 010018)

·基础免疫学·

Rab7基因沉默对巨噬细胞中R848激活的细胞因子及MAPK信号通路影响①

邹 凯 云小乐 康鸿斌②王 雪 张晓慧 谢基明③王玉珍

(内蒙古农业大学生命科学学院，呼和浩特 010018)

目的：本实验阐述了Rab7对Raw264.7巨噬细胞中R848激活TLR7(Toll like receptor-7)所产生的细胞因子的影响，并探讨Rab7对MAPK信号转导的影响。方法：使用Rab7刺激silence-Rab7-Raw264.7细胞，检测R848激活TLR7后产生的TNF-α、IL-6、IFN-α、IFN-β与IP-10，通过Western blot检测MAPK的磷酸化水平，分析Rab7对MAPK的信号转导的作用。结果：Rab7对TLR7激活后细胞因子的产生具有抑制作用，Rab7对MAPK信号通路具有抑制作用。结论：本实验结果进一步说明Rab7 是TLR7信号转导通路的负向调控因子，并且参与到MAPK信号通路中。

Rab7；TLR7；Raw264.7细胞；MAPK

Rab蛋白是小分子三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋白超家族中最大的亚家族之一，Rab蛋白家族成员的特征就是特异地定位在胞质中的某些亚细胞器上，并可能成为他们的标志物[1]。作为Ras蛋白超家族中的一类小G蛋白，Rab7蛋白具有介导晚期胞内体与溶酶体的膜融合、参与晚期蛋白转运到溶酶体过程的特定生物学功能。Rab7通过促进溶酶体的运输还可以清除胞内病毒[2]。Rab7除了调控内吞过程的晚期运输外，还参与了受体的转运，如将表皮生长因子受体转运到溶酶体降解[3,4]。近年来，越来越多的研究表明，Rabs蛋白除了参与调节囊泡的转运外，还广泛地参与了信号转导过程。研究表明，Rab11通过调控JNK和Raf/MAPK-ERK途径调控果蝇翅膀的发育[5]；Rab GTPase 通过调控VEGFR2的转运和信号通路调控内皮细胞的迁移[6]。之前的研究证明，Rab7能够参与细胞凋亡，例如在甲状腺癌中，Rab7的表达量增加[7]。Rab7的过表达能抑制LPS/TLR4及GpG/TLR9信号通路。 同时Rab7很有可能负向调控TLR7信号转导。但是关于Rab7怎样参与调节天然免疫中TLR7信号通路还有待探索。

TLRs广泛表达于固有免疫和获得性免疫系统，通过识别内外源性致病原含有的保守病原体相关模式分子(PAMP)，产生趋化因子和细胞因子，启动天然免疫应答[8]。TLR7是在结构上高度保守的蛋白质，故可以结合单链RNA(ssRNA)病毒[9]。研究发现小鼠TLR7 可以识别用于治疗病毒感染的合成化合物咪唑喹啉，R848(resiquimod，S-28463)是一种合成的鸟嘌呤核苷酸类似物，是一种小分子免疫调节剂，属于咪唑喹啉类化合物家族，通过TLR7-MyD88 信号途径和TLR8 发挥作用。在R848刺激下，TLR7信号通路被活化，产生一系列细胞因子，启动免疫应答。

本实验采用小鼠单核细胞/巨噬细胞株Raw264.7作为模型，构建Rab7-siRNA并转染巨噬细胞，研究Rab7沉默后对R848激活的巨噬细胞Raw264.7中细胞因子的影响。同时，通过免疫印迹技术检测分析R848激活的巨噬细胞中MAPK信号通路的变化情况。本实验为进一步研究Rab7在TLR7信号通路中的作用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料 小鼠巨噬细胞系Raw264.7 购自北京协和细胞库；胰蛋白酶、R848购自Sigma公司； FuGENE HD转染试剂购自Roche；Rab7-siRNA购自上海吉玛制药技术有限公司；OPTI-MEM、DMEM购自Gibco;胎牛血清购自兰州民海生物工程有限公司；BCA生工公司；RIPA细胞裂解液购自碧云天公司；细胞总RNA 抽提试剂Trizol、反转录酶、Taq DNA聚合酶、SYBR RTQ-PCR试剂来自 TaKaRa；actin、p-p38/p38、pJNK /JNK、p-ERK/ERK抗体均购自美国Cell Signaling公司；Western blot二抗购自LI-COR公司。其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 小鼠巨噬细胞株Raw264.7的培养及转染 Raw264.7细 胞 株 接 种 于 含10%胎 牛 血 清 的DMEM培养基中;置37℃，5%CO2的培养箱培养，1～2 d传代一次，置 37℃，5%CO2的培养箱培养。将RAW264.7细胞以2×105/孔的细胞数接种于6孔板上，参照FuGENE HD的说明书进行转染Rab7-siRNA，每孔加入终浓度10 ng/ml的R848。

1.2.2 Real-time PCR 总RNA 的提取采用Trizol提取法，测定浓度后用1 μg RNA进行反转录为cDNA。RT-PCR和Real-time PCR使用的引物序列如表1，Real-time PCR计算方法采用2-ΔΔCt法。

1.2.3 Western blot 检测Rab7沉默对JNK、ERK 和p38MAPK 信号通路的影响

1.2.3.1 细胞总蛋白提取 取转染Rab7-siRNA和未转染的Raw246.7细胞，加入R848处理一定时间后，收集细胞，PBS 洗涤两次，加入RIPA细胞裂解液100 μl，4℃ 14 000 r/min离心10 min，将上清按需分装，保存于-70℃，蛋白浓度以BCA试剂盒进行蛋白定量。

1.2.3.2 Western blot 各组取等量蛋白提取液，经SDS-PAGE电泳分离，电转移至PVDF 膜上;取膜并用Odssey Blocking Buffer封闭后，与兔抗鼠p-JNK/JNK、p-ERK/ERK和p-p38 /p38 MAPK 的单克隆抗体(1∶1 000)于4℃反应过夜，洗膜后再与羊抗兔IRDye800CW二抗(1∶15 000)室温反应2 h，洗膜后利用ODYSSEY CLX检测特异性蛋白条带，采用Imagine Studio软件分析结果。

1.3 统计学分析 应用SPSS17.0软件进行t检验分析，P< 0.05认为差异具有统计学意义，P< 0.01认为差异具有极显著统计学意义。

2 结果

2.1 R848刺激Raw264.7细胞后对Rab7mRNA表达水平的影响 我们研究了TLR7 配体R848活化的信号通路对Rab7表达的影响。在R848刺激Raw264.7细胞不同时间后,用RT-PCR和Real-time PCR研究Rab7 mRNA的表达量变化。如图1A所示，R848刺激后Rab7 mRNA表达量在6 h达到最大。之后逐渐降低。通过Real-time PCR验证在R848刺激后4 h Rab7的表达量是初始量的3倍之多，6 h达到最高，是初始量的6倍。上述结果表明，R848正向调控Rab7的表达。由此我们推断Rab7可能参与了R848/TLR7信号转导途径。

表1 引物序列

Tab.1 Primers sequence

NameSequenceLength(bp)Rab7-sence5'-CACTTTCAAAACCCTCG-3'324Rab7-antisence5'-TTCTTGGCACTGGTCTCG-3'IL-6-sence5'-CTTGGGACTGATGCTGGTG-3'378IL-6-antisence5'-CTGGCTTTGTGTTTCTTGTT-3'TNF-α-sence5'GAGTGACAAGCCTGTAGCC-3'461TNF-α-antisence5'-AACACCCATTCCCTTCAC-3'IFN-β-sence5'-CGTTCCTGCTGTGCTTCT-3'162IFN-β-antisence5'-GTCCGCCCTGTAGGTGAG-3'IP-10-sence5'-TGCCGTCATTTTCTGCCT-3'148IP-10-antisence5'-GGTCATCATTCTTTTTCATCGT-3'β-actin-sence5'-AGTGTGACGTTGACATCCGT-3'298β-actin-antisence5'-GCAGCTCAGTAACAGTCCGC-3'IFN-α-sence5'-GGAATCCAAAGTCCTTCCTGTCCT-3'173IFN-α-antisence5'-CTGTGCTTTCCTGATGGTCCTG-3'

2.2 Rab7沉默后对R848诱导的小鼠巨噬细胞中TNF-α、IL-6的影响 Rab7对R848刺激后，巨噬细胞内IL-6和TNF-α的分泌主要受MyD88依赖途径调控。从图2中可以看出，Rab7沉默后，R848诱导的巨噬细胞中IL-6和TNF-α的分泌增加。结果说明，Rab7对R848诱导的Raw264.7细胞中IL-6和TNF-α有抑制作用。

2.3 Rab7沉默后对R848诱导的小鼠巨噬细胞中IFN-α、IFN-β的影响 前面的研究结果显示，Rab7能够抑制R848诱导的巨噬细胞中IL-6和TNF-α的分泌，这两个细胞因子主要是依赖TLR7/MyD88信号通路。而IFN-α、IFN-β是由MyD88非依赖通路激活转录因子IFR-7调控的，因此，我们通过Real-time PCR检测Rab7沉默后IFN-α、IFN-β的变化。如图3所示，Rab7沉默后IFN-α、IFN-β的表达显著增加，说明Rab7对IRF-7信号通路也有抑制作用。

2.4 Rab7沉默后对 R848诱导的小鼠巨噬细胞中IP-10的影响 我们还检测了MyD88非依赖途径产生的下游细胞因子IP-10的表达量变化。从图4可以看出，R848刺激Rab7沉默后对IP-10 mRNA表达并没有显著的影响。

图1 R848刺激Raw264.7细胞不同时间Rab7的变化Fig.1 Detection of Rab7 expression in Raw264.7 cellNote: A.The result of RT-PCR detection; B.The result of Real-time PCR；*.P<0.05,**.P<0.01.

2.5 Rab7对 R848诱导的小鼠巨噬细胞中MAPK信号通路的影响 为了考察Rab7沉默后R848诱导小鼠巨噬细胞中MAPK信号通路，用R848处理培养的Rab7-siRNA转染的RAW246.7细胞，观察MAPK 信号通路三个主要成员，即ERK1/2、JNK、p38 MAPK 变化。用Western blot的方法检测R848处理后三个信号转导蛋白的磷酸化水平变化。结果显示，当R848作用于Rab7-siRNA转染的RAW246.7细胞后，ERK的磷酸化在40 min显著升高；JNK的磷酸化水平在20～40 min内增高，随后降低；而p38 MAPK 的磷酸化水平变化不是特别明显，见图5。表明，Rab7对R848激活的巨噬细胞中MAPK信号通路具有抑制作用，抑制ERK 和JNK信号通路，其中抑制ERK的磷酸化尤为明显；而对p38 MAPK信号通路的抑制作用不太明显。

图2 mRab7抑制R848诱导的TNF-α、IL-6的表达Fig.2 mRab7 inhibited expression of TNF-α and IL-6Note: The result of Real-time PCR. The figure represent the mean result of three independent experiments, *.P<0.05,**.P<0.01.

图3 mRab7抑制R848诱导的IFN-α、IFN-β的表达Fig.3 mRab7 inhibited expression of IFN-α and IFN-β Note: The result of Real-time PCR. The figure represent the mean result of three independent experiments, *.P<0.05.

图4 mRab7抑制R848诱导的IP-10的表达Fig.4 mRab7 inhibited expression of IP-10Note: The result of Real-time PCR. The figure represent the mean result of three independent experiments.

图5 Rab7对MAPK信号通路的影响Fig.5 Effect of Rab7 on MAPK pathway Note: A.Western blot analysis with R848(10 ng/L) stimulation;B.Quantitative analysis by software (ODYSSEY imagine studio).

3 讨论

Rab蛋白参与胞膜的转运与信号转导过程。之前的研究证明了Rab7可能是TLR7信号转导的负向调控因子，并且这种作用依赖于Rab7与GDP结合的活性形式。本文结果表明:Rab7沉默后的小鼠巨噬细胞中，TLR7被相应的配体R848激活后，MyD88接头蛋白活化下游信号通路激活的细胞因子例如TNF-α、IL-6的表达显著增加，这进一步说明Rab7对TLR7激活后的MyD88依赖途径具有抑制作用，而这一点可能与细胞因子导致细胞凋亡、引起炎症的发生有关。Rab7负责抑制TNF-α、IL-6的产生，其作用机理还有待进一步的实验研究。TLR7与其配体结合后，TRIF途径(MyD88非依赖途径)主要活化产生IFN-α、IFN-β、IP-10和CxC趋化因子等细胞因子。文中结果表明，Rab7沉默后的小鼠巨噬细胞中，IFN-α、IFN-β的表达量变化明显，显示Rab7也作用于TRIF途径。

ERK相关的细胞内信号转导途径被认为是经典MAPK信号转导途径，参与细胞增殖与分化、细胞形态维持、细胞骨架的构建、细胞凋亡和细胞的癌变等多种生物学反应。JNK信号转导通路是MAPK通路的一重要分支，它在细胞周期、生产、凋亡和细胞应激等多种生理和病理过程中起重要作用。P38MAPK信号通路具有负向调节细胞周期的功能，对肿瘤的抑制作用，具有促进细胞生存的能力。本实验结果表明，Rab7对MAPK信号通路具有抑制作用，对ERK的抑制作用尤为显著，这可能与巨噬细胞受到刺激导致的分化与增殖有关。本实验证实了不仅Rab7对TLR7激活的MyD88途径具有抑制作用，在MAPK信号转导中也发挥着作用，抑制MAPK信号转导的产生，作用机理和意义有待于进一步的实验揭示。

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[收稿2017-02-14]

(编辑 倪 鹏)

Effects of Rab7 gene silencing on cytokine and MAPK signal pathway activated by R848 in macrophage

ZOUKai,YUNXiao-Le,KANGHong-Bin,WANGXue,ZHANGXiao-Hui,XIEJi-Ming,WANGYu-Zhen.

CollegeofLifeScience,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Hohhot010018，China

Objective:To investigate the effect of Rab7 on cytokine induced by TLR7 (Toll like receptor-7) R848 activated in Raw264.7,and discusses the influence of Rab7 on MAPK signal transduction.Methods: TLR7 downstream cytokines such as TNF-α,IL-6,IFN-α,IFN-β and IP-10 activated by R848 were detected through Q-PCR in Rab7 silenced mouse macrophages,and then analysis of phosphorylation of MAPK determined with Western blot showed the effect of Rab7 on signal transduction of MAPK.Results: Rab7 inhibit production of cytokine activated by TLR7,and also,Rab7 had an inhibitory effect on MAPK signal pathway.Conclusion: The experimental results further illustrate that the Rab7 is the TLR7 signal transduction pathway negative regulatory factor,and to participate in MAPK signaling pathway.

Rab7;TLR7;Raw264.7 cell;MAPK

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.07.002

①本文受国家自然科学基金(31270922，81360394)和内蒙古自治区硕士研究生创新基金(520151012907，520151012908，2015ms08 124)资助。

邹 凯(1992年-)，男，在读硕士，主要从事分子免疫与分子病理学方面研究，E-mail：1787748699@qq.com。

及指导教师：王玉珍(1976年-)，女，博士，教授， 主要从事天然免疫应答调控方面的研究，E-mail：wangyuzhen817@126.com。

R392

A

1000-484X(2017)07-0967-04

②内蒙古医科大学第一附属医院，呼和浩特010010。

③内蒙古自治区人民医院检验科，呼和浩特010020。