新疆芜菁小孢子培养成胚影响因素研究

轩正英++马国财

摘要：以8个新疆芜菁（Brassica rapa L.）品种为试材，对影响小孢子培养中胚胎发育的影响因素进行了研究。结果表明，不同基因型间小孢子胚胎发生能力差异很大，在接种的8个基因型中，有4个诱导出胚，诱导成功率50%，其中W4出胚率最高，达到73胚/30蕾。NLN-13培养基中添加激素能明显促进胚状体的发生；低温预处理也能提高小孢子产胚率，最适宜的时间为24 h。

关键词：新疆芜菁（Brassica rapa L.）；小孢子培养；出胚率

中图分类号：S631.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）13-2540-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.13.036

Studies on Factors Influencing Embryogenesis of Isolated Microspores of

Xinjiang Turnips

XUAN Zheng-ying1， MA Guo-cai2

（1. Colldge of Plant Science，Tarim Univercity，Alar 843300，Xinjiang，China；

2. Analytic & Test Center， Tarim University，Alar 843300，Xinjiang，China）

Abstract： In order to optimize microspore culture techniques of Brassica rapa L. and improve the embryo induction rate， the influence factors to microspore embryogenesis of Brassica rapa L. were studied through eight genotypes. Results showed that there was significant difference in embryogenesis ability among different genotypes. Among them， four genotypes yielded embryos successfully， which the rate reached 50%. Genotype W4 was an ideal material for embryoid induction， and the frequency reached 73 embryos per 30 buds. NAdding phytohormone 6-BA and NAA in NLN-13 medium can improve the embryoid induction，4 ℃ pretreatment of bud for 24 h can significantly improve the production rate of microspore embryogenesis.

Key words： Xinjiang turnip（Brassica rapa L.）；culture of pollen；rate of embryo formation

芸薹属蔬菜属于异花授粉作物，其杂种优势明显。近年来，常规育种的不足在实际工作中日渐明显，目前小孢子培养技术由于培养方法日趋完善，培养效率逐年提高，使其开始被广泛应用于常规杂交育种，逐渐成为作物改良和新品种培育工作的一个重要手段。芸薹属植物游离小孢子培养始于1982年，Lichter[1]首次报道在甘蓝型油菜上成功地用游离小孢子培养方法得到了胚状体，目前小孢子培养已在大部分芸薹属作物中获得成功[2-7]。关于新疆芜菁游离小孢子培养方面鲜见报道，乔丽桃[7]对新疆本土栽培芜菁品种进行游离小孢子培养，并诱导形成小孢子胚和再生植株。

芜菁（Brassica rapa L.，2n=20）含有芸薹属中最难进行离体再生的AA基因组，离体条件下小孢子发育具有不同步性和多种发育途径并存，又是再生困难的根部膨大类作物，游离小孢子培养离体再生尤为困难，这严重影响了小孢子培养技术在芜菁育种上的应用。本试验针对新疆芜菁花粉游离小孢子培养技术体系中几个有利于诱导出胚的因素，探讨新疆芜菁游离小孢子培养形成胚状体以及有利于提高出胚率的方法，旨在建立高效、稳定的新疆芜菁游离小孢子培养技术体系，也为新疆芜菁新种质资源的发掘奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料详情见表1、图1。

1.2 试验方法

1.2.1 试材准备 材料于2016年1月9日播种于日光温室进行自然春化处理，3月9日芜著小苗在温室外继续低温春化，3月27日定植于塔里木大学园艺试验站试验田，4月中旬开花。采用常规田间管理措施培养母株。

1.2.2 游离小孢子培养 芜菁植株现蕾后，于每天9：00～11：00摘取健壮植株的花序，参考徐艳辉等[8]方法进行小孢子培養。

1.2.3 基因型对小孢子胚胎发生的影响 8种试材严格挑选长2.00～2.49 mm处于单核靠边期的花蕾，进行游离小孢子培养[9]。

1.2.4 培养基激素成分对小孢子胚诱导的影响 以W4和W8为试验材料，在NLN-13液体培养基中添加不同浓度6-BA、NAA 2种激素进行比较试验（表2），共7组处理，观察诱导其成胚的情况，计算出胚率。

出胚率=出胚数/花蕾总数

1.2.5 低温预处理对胚状体诱导率的影响 选用新疆芜菁品种W4、W8为试材，将采集的花蕾置于0～4 ℃冰箱中低温处理0（CK）、24、48、72 h后，按上述游离小孢子培养方法培养在培养皿中，并置于33 ℃恒温箱中黑暗培养1 d后，再转放在25 ℃下静置黑暗培养，研究4 ℃低温预处理时间对小孢子出胚率的影响。

2 结果与分析

2.1 新疆芜菁小孢子胚状体类型

供试材料分离的小孢子在NLN-13培养基中培養，经高温热激转入25 ℃暗培养，7 d左右有肉眼可见的白色细小颗粒，后逐渐形成球形胚、心形胚、鱼雷形胚、子叶形胚及畸形胚，如图2所示。观察发现，芜菁胚状体发育存在极大的不同步现象，且畸形胚比例偏高，子叶型胚比例偏低，萌发胚极少出现。

2.2 基因型对芜菁游离小孢子出胚率的影响

不同基因型的芜菁小孢子胚胎发生能力差异很大。供试材料包含白皮、绿白皮和红皮多种类型， 由表3可以看出，8个芜菁品种有4个得到了胚状体，成功率达50%。芜菁W4出胚数最高为73胚/30蕾，其次为W8和W1， 出胚数分别为58胚/30蕾和41胚/30蕾，最低为W5，出胚数为24胚/30蕾，其余4个基因型则无胚状体产生。

2.3 低温预处理对芜菁游离小孢子出胚率的影响

以胚产量高的W4和W8为试材，对采集到的花蕾进行0～4 ℃的低温处理，结果（表4）表明，低温预处理后小孢子出胚率差异很大，低温处理24 h的小孢子出胚率最高，平均出胚率为2.18 胚/蕾，高出对照2.05，而经48、72 h低温处理的出胚效果较差，平均出胚率分别为1.18胚/蕾和0.20胚/蕾，出胚率均高于对照。由此表明，花蕾低温处理能使其小孢子培养胚产量增加；也说明适宜的低温预处理，即24 h可以大大提高芜菁小孢子培养的出胚率，但随着低温处理时间的延长，反而会降低其出胚率。

2.4 外源激素对芜菁游离小孢子出胚率的影响

通过对供试W4、W8材料在NLN-13液体培养基中添加不同浓度外源激素6-BA与NAA，进行小孢子诱导胚状体培养。结果（表5）表明，培养基中添加外源激素能显著提高胚状体的产量，7种激素浓度配比中2个试材的平均出胚率分别为0、0.30、1.62、1.72、0.52、0.53、0.08胚/蕾。处理1和7、处理3和4、处理5和6的平均出胚率在P<0.05和P<0.01水平上没有显著差异。就供试材料而言，不同材料对激素的需求也有差异，W4以单独添加0.05 mg/L NAA的出胚率最高为2.43胚/蕾；W8以添加0.05 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA最高，为1.93胚/蕾。

3 讨论

供体材料的基因型是小孢子培养胚状体发生的关键因素之一，不同基因型、不同作物的变种以及同一变种之间不同基因型的供体植株，在统一的试验条件下，游离小孢子培养胚诱导率有很大差异。轩正英等[10]对7个大白菜材料进行试验，有6个获得了胚状体，成功率达85.71%。乔丽桃[7]通过4份芜菁材料对游离小孢子培养进行了初步研究，仅有1份材料得到胚状体。本试验以8个新疆芜菁特异品种为试材进行花粉游离小孢子培养，只有4个供试材料诱导出胚。材料W4出胚率最高为2.43胚/蕾；W5最低，出胚率仅为0.80胚/蕾。相对于白菜、甘蓝型油菜等作物，芜菁的胚诱导率很低，这也说明芜菁是十字花科作物中难诱导的种类。笔者研究发现，挑选单核靠边期花蕾，不同材料之间合适的花蕾大小差异较大，且受环境条件影响变动也较大，因此单纯通过花蕾大小来判断单核靠边期花蕾误差较大。

前人对游离小孢子培养中低温预处理的研究有不同观点，有研究者认为0～4 ℃低温预处理使花药不对称的有丝分裂进行对称分裂[11]，也有研究者认为低温处理只是对材料进行短暂保存，对胚状体的发生无明显作用[12]。本研究结果表明，对新疆芜菁花蕾进行0～4 ℃低温预处理能有效提高花粉小孢子胚状体发生频率，但低温处理时间不可过长，处理24 h为最佳时间，有效提高了出胚率，这一结果与Sato等[13]关于冷击预处理花蕾能提高小孢子胚发生频率的结果相符。

培养基中添加的激素成分、激素用量以及激素的配比等，对诱发小孢子启动以及细胞生长分裂起到重要作用。徐艳辉等[8]通过对大白菜小孢子培养胚状体发生的研究发现，0.2 mg/L 6-BA对小孢子胚状体的发生有一定的促进作用。李岩等[14]研究表明在小白菜培养时在培养基中添加少量激素（NAA 0.5 mg/L、BA 0.05 mg/L）有利于小白菜游离小孢子的胚胎发生，其胚产量明显高于不加外源生长物质的对照。桑玉芳[15]在对甘蓝小孢子培养中发现，外源激素对小孢子成胚具有重要作用，但不同基因型材料对激素作用的表现不同。本试验通过不添加外源激素的培养基与添加了不同浓度配比的6-BA与NAA的NLN-13培养基进行比较试验。结果表明，添加激素可以显著提高芜菁小孢子培养的出胚率，且不同材料对激素的需求也有差异，W4以单独添加0.05 mg/L NAA的出胚率最高，为2.43胚/蕾；W8以添加0.05 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA最高，为1.93胚/蕾。这一结果与前人研究结果不尽相同，究其原因可能与新疆芜菁品种资源的遗传多样性和变异有关。

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