猪伪狂犬病疫苗研究及应用现状

任卫科+池晶晶+李秀丽+鄢明华+张莉

摘 要： 猪伪狂犬病（pseudorabies， PR）是由伪狂犬病毒（pseudorabies virus， PRV）引起的猪的一种急性传染病，对世界养猪业危害严重。疫苗免疫是预防和控制猪伪狂犬病的主要措施之一。目前，国内外临床应用的猪伪狂犬病疫苗包括灭活疫苗、弱毒疫苗和基因缺失疫苗。近年来，随着我国伪狂犬病的反弹和流行，伪狂犬病防控和疫苗研究再次成为研究热点。本文对猪伪狂犬病疫苗的研究及使用现状进行了较为详细的综述。

关键词： 猪；伪狂犬病；疫苗；现状

中图分类号：S852.4 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.08.009

Abstract：Pseudorabies （PR） is an acute infectious disease caused by pseudorabies virus （PRV）， which causes great losses to the pig industry in the world. Now， vaccination remains one of the main measures to prevent and control PR. At present， clinical application of PR vaccine at home and abroad include inactivated vaccine， attenuated vaccine and gene deleted vaccine. In recent years， with the rebound and epidemic of PR in China， the prevention and control of PR and vaccine research have become the focus of research again.In the article， the research and application status of PR vaccines were reviewed in detail.

Key words： swine； pseudorabies； vaccine； status

偽狂犬病（pseudorabies， PR）是一种由伪狂犬病病毒（pseudorabies virus， PRV）引起的以多种家畜及野生动物为主的以发热、奇痒、呼吸和神经系统障碍为主要特征的急性传染病[1]。该病感染猪后可引起母猪流产，产死胎和木乃伊胎；仔猪发病后表现发热、腹泻和神经症状，两周龄内仔猪死亡率可达100%。20世纪90年代以来，随着PR基因缺失疫苗（Bartha-K61株）的引入并广泛使用，该病在我国大部分地区得到有效控制[2-4 ]。然而，自2011年以后，我国华东、华中、华北及东北等地区的疫苗免疫猪群中相继出现了PR疫情，部分地区甚至大规模爆发，并呈现逐渐蔓延的趋势，给养猪业造成新的威胁[5-6]。这些发病猪场大多都免疫过PR基因缺失疫苗，并表现出了新的流行特点[7-9]。

近期的研究结果表明，新的PRV流行株部分毒力基因相比以前的流行毒株已经发生了变异，且对仔猪的致病性有所增强，现有的疫苗不能完全保护免疫猪抵抗PRV流行株的攻击[10-12]。对于该病的防控，国内外均以疫苗免疫预防为主，结合伪狂犬病毒gE抗原和gE抗体检测淘汰、净化野毒感染猪。目前，临床应用的PR疫苗大体可分为以下三类：一是将分离的野毒或强毒经甲醛灭活后，加佐剂乳化制成油乳剂灭活疫苗；二是将分离的野毒或强毒经非猪源细胞或者鸡胚反复传代致弱研制的弱毒疫苗；三是利用基因工程技术构建的基因缺失疫苗。这些疫苗在PR的防控方面起到了非常重要的作用。此外，一些基因工程疫苗例如核酸疫苗、亚单位疫苗及重组疫苗尚在研究之中。本研究拟对PR疫苗研究进展及其在我国养猪生产中的应用现状进行详细阐述。

1 灭活疫苗

2001年陈焕春等[13-14]应用PRV分离株Ea株研制成功我国第一个全病毒油乳剂灭活疫苗。该疫苗免疫效力较好，后备母猪免疫4周后血清中和滴度可高达1∶1 412，对新生仔猪和断奶仔猪保护率分别为90.6%，100.0%。2014年，Gu等[15]利用细菌人工染色体技术（BAC）缺失了PRV流行株ZJ01株的gE/gI基因，构建了PRVZJ01△gE/gI株，将该病毒用福尔马林灭活后，添加佐剂Montanide ISA 206 研制成功PRVgE/gI双基因缺失灭活疫苗。用该疫苗免疫4周龄仔猪，二免后3周用1 mL 106.0 TCID50·mL-1的PRV-ZJ01株鼻内攻击，结果攻毒对照猪7 d内全部死亡，而vZJ01△gE/gI株灭活疫苗免疫组猪未出现临床症状，但免疫过两次PRBartha-K61株疫苗的试验猪均出现一过性痉挛及共济失调症状。2015年，Wang等[16]基于分离的PRV流行株HN1201构建了gE基因缺失株（PRV-HN1201ΔgE株），灭活后添加佐剂Montanide ISA 206研制出PRVgE基因缺失灭活疫苗。该疫苗免疫3周龄小猪4周后用1 mL 107.0 TCID50·mL-1亲本强毒PRV-HN1201滴鼻攻击，攻毒后免疫猪仅有一过性发热，没有其他临床症状，但有两头在攻毒后第2天经鼻拭子检测到排毒现象，持续3天；对照组攻毒后14天所有对照猪全部死亡，且攻毒后第1天至死亡时，均可经鼻拭子检测到排毒。

目前，我国临床使用的PR灭活疫苗主要是PRV Ea株全病毒油乳剂灭活疫苗，但由于该疫苗不能区别免疫猪和野毒感染猪，在PR基因缺失活疫苗上市以来临床上使用越来越少，近年来市场占有率已经不足5%。

2 弱毒疫苗

PR弱毒疫苗是将分离到的野毒株经非猪源细胞或鸡胚反复传代，或在高于一般培养温度条件下加入致突变剂在细胞培养基上反复传代而获得。由于其特殊的自然基因缺失的特点，再加之免疫原性优良，生产工艺简便易行，在控制及净化世界范围PR的流行中起到至关重要的作用。目前，已经报道的PR弱毒疫苗有Bartha-K61株、Bucharest株和JS-2012-F120株。其中Bartha-K61和Bucharest株弱毒疫苗应用最为广泛[17-18]。

Bartha株是由匈牙利科学家Bartha于1961年分离的强毒株经鸡胚细胞传代致弱的[19]。致病力试验结果显示，Bartha株对部分小动物仍有一定的致病性，例如对小于4月龄的狗和猫以及小于2 kg家兔可引起50%发病死亡或麻痹；但对其他动物的痒症诱发力已消失。研究表明，该疫苗免疫后7 d就可产生抗体，5周可以达到高峰，且高水平的抗体可以维持长达2个月以上[20]。近年来，研究者用分子生物学技术分析该疫苗株的基因结构，发现该疫苗基因组中US区存在整个gE基因缺失，11 k和部分gI、28 k片段的缺失；在UL区gC基因信号肽存在点突变，UL21存在8个点突变[21-23]，UL10即gM基因也存在点突变[24]。由于gE、gC基因是PRV的重要毒力基因，因此，gE基因的缺失及gC基因的点突变可能导致该毒株的毒力下降。

Bucharest株弱毒疫苗是由罗马尼亚的布加勒斯特兽医所通过将PR强毒株在鸡胚尿囊膜上培养至200 代后致弱而成。Bucharest株的基因特点同Bartha-K61株相似，也在US区绝大部分的gE基因发生缺失。该疫苗同样存在一定的毒力，对小鼠、豚鼠和家兔有一定较强的毒力；在猪上仅适用于9 日龄以上的仔豬和妊娠2月的母猪[25]。

JS-2012-F120株弱毒疫苗是2017年由LIANG C等[26]将亲本毒JS-2012株在vero细胞上处于40 ℃的条件下连续传代120代研制成功的。利用PCR和序列分析发现，该疫苗株发现缺失了2 307 bp，这段缺失的范围是从gE基因的487位核苷酸到US2基因的531位核苷酸之间。用105TCID50 JS-2012-F120接种2周龄的哺乳仔猪后发现，该疫苗株对仔猪无任何不良反应，而且能同时保护免疫猪被经典PRVSC株和变异PRVJS-2012株的攻击。

Bartha-K61株疫苗是20世纪70年代末由中国农科院哈尔滨兽医研究所的袁庆志等[27]从匈牙利引进并研制成的弱毒疫苗，目前在我国广泛使用，是我国PR防控中应用最多的疫苗[28]，对经典PR强毒具有良好的免疫保护效果，但对我国2011年以来流行的PR强毒株，免疫保护效果不佳[10-12]。Bucharest疫苗是用鸡胚培养后制成的冻干苗，目前在我国应用范围不广。

3 基因工程缺失疫苗

PR基因工程缺失疫苗是利用基因工程操作技术将PRV基因中对生长非必需毒力基因或糖蛋白基因进行切除或插入，使其彻底失活，但又保持PRV的免疫原性而获得的疫苗。已经报道的PRV基因缺失疫苗主要有3种：单基因缺失疫苗、双基因缺失疫苗和多基因缺失疫苗。目前，我国市场上应用的主要是HB-98株双基因缺失疫苗（TK基因和gG基因）和刚上市的SA215株三基因缺失疫苗（gE基因、gI基因和TK基因）。

3.1 单基因缺失疫苗

PR单基因缺失疫苗其代表疫苗株是PRV BUK-d13株，该疫苗是20世纪80年代Kit等[29]将强毒株PRV-BUK TK中的基因缺失掉148 bp基因序列构建所得。动物试验证明该疫苗对猪安全，并能提供有效的保护，5～6周龄猪在免疫接种该疫苗后能产生中和抗体，在攻毒后可以表现出再次免疫应答能力。在国内，周复春[30]和王琴等[31]先后用分离的强毒株Ea株和Fa株构建了TK基因缺失疫苗，动物试验证明对小鼠有保护作用。但是该疫苗有个致命的缺点，即无法区别PR疫苗免疫接种猪和野毒感染猪，原因在于TK基因属于酶蛋白基因，不能在猪体内产生相应的抗体。

3.2 双基因缺失疫苗

PR双基因缺失疫苗相比PR单基因疫苗有很大优点，由于缺少2个毒力基因，因而所构建的疫苗毒力进一步降低，对免疫动物安全性也更高。另外，在非编码必需糖蛋白的基因内引入了一个新的缺失或插入一个报告基因，这样得到的突变株疫苗免疫动物后就不能产生被缺失的糖蛋白抗体，从而可以通过血清学方法将免疫猪与野毒感染猪相区分。1987年Kit S等[32]在PRV-d13株的基础上，通过缺失gC基因序列的1 100 bp，构建了PRV-delTK/gC双基因缺失疫苗株，动物试验证明该缺失疫苗接种动物后不能产生抗gC的抗体。何启盖[33]用经典强毒株Ea株构建了TK和gG双基因缺失株PRV HB-98株。该疫苗株动物试验表明应用比较安全，且免疫原性表现优良，例如用病毒量为107.0 TCID50的PRV HB-98株接种BALB/c小鼠不会引起小鼠死亡，其毒力明显低于Bartha-K61株。同样，用病毒量为107.0TCID50PRV HB-98株接种妊娠50～60 d母猪和1日龄仔猪，母猪均能正常产仔，仔猪也未出现任何临床症状；用病毒含量为105.0 TCID50的PRV HB-98株免疫妊娠50～60 d母猪和1日龄仔猪，分别在免疫后28，20 d，用107.0 TCID50 PRV-Ea株强毒进行攻击，结果所有免疫猪均得到良好的保护，未表现异常状况[34]。该疫苗株于2006年获得国家新兽药注册证书和生产许可证[35]，目前在我国应用较为广泛。近年，有学者用分离的PRV变异株构建PR双基因缺失疫苗在动物试验中表现出良好免疫原性，例如2014年Wang等[16]用PRV变异株TJ株构建的rPRVTJ-delgE疫苗以103，104和105TCID50 的剂量分别免疫6周龄仔猪，1 周后用TJ株攻击，结果所有免疫猪均未表现出任何临床症状。2016年Tong W等[36]用分离的变异株PRV JS-2012株构建了gE和gI双基因缺失苗株PRV-JS-2012-△gE/gI，用病毒含量为105.0TCID50的该疫苗株鼻内接种2周龄小猪，4周后同样用病毒含量为105.0TCID50PRV经典强毒株SC株和PRV亲本变异株JS-2012株鼻内攻击免疫猪，结果免疫猪均得到100%的保护。

3.3 三基因缺失疫苗

2003年陈陆[37]将PRV-Fa株通过酶切、同源重组等基因操作方法，去掉其主要毒力基因gE、gI和TK，构建了独特的三基因缺失株SA215。该疫苗已经获得国家二类新兽药证书，也是第一个在我国注册上市的PRV三基因缺失疫苗。该疫苗臨床应用证明对1日龄仔猪、妊娠60 d的母猪、牛、羊以及家兔均安全，无任何反应，接种动物不排毒。用病毒含量为105PFU的SA215株疫苗肌注免疫的3周龄猪，免疫对照组用Bartha株，4周后再用病毒含量为107PFU PRV-Fa强毒株鼻内攻击所有免疫猪，攻毒后所有攻毒试验猪均出现一过性发热期、增重受阻和散毒，但免疫SA215株疫苗的发热期、增重受阻天数和散毒的滴度均低于Bartha株疫苗免疫猪[38]。2015年Zhang C L等[39]利用BAC技术将分离的变异PRV HN1201株缺失了TK、gE和gI 3个基因，构建了三基因缺失疫苗vPRV HN1201TK-/gE-/gI-株。用剂量为107.0 TCID50 的该疫苗经滴鼻免疫9日龄哺乳仔猪，4周后用同样剂量的亲本毒变异PRV HN1201株鼻内攻击，结果免疫组的猪中只有2/5的猪出现一过性的体温增高，再无其他症状，且攻毒14 d后免疫猪的PRV gE抗体均为阴性。胡睿铭[40]利用基因同源重组技术将变异PRV SMX/2012株缺失了TK、gE和gI基因后构建了基于变异株的三基因缺失疫苗rSMX△gI/gE△TK株，该疫苗安全性较高，使用剂量为107.0 TCID50接种小鼠和家兔，均未有不良反应。用剂量为108.0 TCID50接种绵羊，同样未有任何临床症状。同样，用剂量为108.0 TCID50经滴鼻或肌注接种1日龄仔猪和妊娠母猪，均未有任何不良反应，且同窝或同群猪未检测到PRV抗体。该疫苗的免疫效力明显优于Bartha-K61株，例如用该疫苗剂量为106.0 TCID50 肌注免疫21日龄的仔猪，对照组用剂量为106.3 TCID50 Bartha-K61株免疫，免疫后28 d用107.0 TCID50剂量的亲本毒PRV SMX/2012滴鼻攻击所有免疫猪。结果显示，rSMX△gI/gE△TK免疫猪仅出现一过性体温略升高，没有超过41 ℃，攻毒后3 d的排毒峰值为103.3TCID50，而Bartha-K61株免疫猪攻毒后体温升高至41 ℃以上，且有严重的呼吸症状，3/5的猪只出现神经症状，且持续了4～6 d，虽未造成死亡，但也失去饲养价值。Cong等[41]在变异PRV双基因缺失疫苗rPRVTJ-delgE/gI株的基础上删除了TK基因，构建了rPRVTJ-delgE/gI/TK。该疫苗株相对于其亲本rPRVTJ-delgE/gI株安全性有了很大的提升，例如rPRVTJ-delgE/gI/TK株对小鼠的LD50高于106.0 TCID50，而rPRVTJ-delgE/gI株对小鼠的LD50为104.13TCID50；用105.0 TCID50的rPRVTJ-delgE/gI/TK株疫苗和rPRVTJ-delgE/gI株分别接种18月龄的绵羊，结果rPRVTJ-delgE/gI接种绵羊全部死亡，而rPRVTJ-delgE/gI/TK接种羊全部存活，且未表现出任何临床症状。

4 结论与展望

PR是威胁世界养猪业的主要疾病之一，该病在传入我国后，曾经给我国的养猪业造成巨大的经济损失，但在以Bartha-K61株为主的基因缺失疫苗得到广泛应用以后，该病在我国得到很好的控制，许多猪场还完成了伪狂犬野毒的净化。然而，2011年以来猪伪狂犬病的重新流行和反弹，使我国养猪业再次蒙受严重的损失。研究发现，PRV流行株基因组已经发生变异，现有商品化疫苗不能完全保护免疫猪抵抗新的PRV流行株的攻击，因此，如何防控PR的发生和流行，研究开发针对PRV流行株的伪狂犬病疫苗，迫在眉睫。令人欣喜的是，近两年来我国兽医科研工作者已经在预防PR疾病和净化PR方面取得重要进展，新的PR流行变异株基因缺失疫苗也相继被研究成功，虽然新疫苗距离临床使用仍需一段时间，但相信在广大兽医研究工作者的共同努力下，新的PR流行株疫苗将在PR预防、控制和净化过程中发挥重要作用。

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