苗药大果木姜子总黄酮与糖类成分含量测定

刘刚 刘育辰 康雪佳

摘要[目的]建立测定大果木姜子中总黄酮、总糖、还原糖、多糖含量的方法。[方法]以芦丁和葡萄糖为对照品，采用紫外分光光度计测定大果木姜子中总黄酮、总糖、还原糖、多糖的含量并进行方法学考察。[结果]大果木姜子中总黄酮含量为（8.02±0.19）mg/g，总糖含量为（35.26±0.96）%，还原糖含量为（4.78±0.95）%，多糖含量为（30.53±0.69）%。[结论]该方法快速、简便、准确，可以用于大果木姜子中总黄酮、总糖、还原糖、多糖的含量测定。

关键词 大果木姜子；总黄酮；总糖；还原糖；多糖；紫外分光光度法

中图分类号 S789.5 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）03-0141-04

Abstract[Objective] To establish the method for determination of total flavonoids， total sugar， reducing sugar， and polysaccharide in Cinnamomum migao. [Method] Using rutin and glucose as control products， the contents of total flavonoids， total sugar， reducing sugar and polysaccharide in C. migao were detected by UV spectrophotometer， and experiments were conducted to investigate whether the method is feasible. [Result] The contents of total flavonoids， total sugar， reducing sugar， polysaccharide in C. migao were （8.02±0.19）mg/g， （35.26± 0.96）%， （4.78±0.95）%， （30.53±0.69）%， respectively.[Conclusion] The method is rapid， simple， accurate， which is able to accomplish the content determination of total flavonoids， total sugar， reducing sugar， polysaccharide in C. migao.

Key words Cinnamomum migao；Total flavonoids；Total sugar；Reducing sugar；Polysaccharide；UV

苗藥大果木姜子为樟科植物米槁（Cinnamomum migao H.W.Li）的干燥成熟果实[1]，味苦、辛，性温，能够散寒祛湿、行气止痛，临床用于治疗胸腹疼痛、胸闷腹胀、哮喘等[2]。大果木姜子已被收录《贵州省中药材、民族药材质量标准》（2003年版）[3]，是一些治疗心绞痛、冠心病、胃脘疼痛等苗药制剂的主要原料，如金喉健喷雾剂等。黄酮类化合物属于植物的次级代谢产物[4]，是广泛存在于植物界的一类天然产物，同时也是许多中草药的有效成分，具有很高的药用价值。中药多糖是一种天然的大分子，来源广泛且没有毒性，具有多种药理活性，尤其是对免疫系统有重要的调节作用[5]。目前对于大果木姜子化学成分的研究主要集中于挥发油[6-8]，而对大果木姜子的糖类以及黄酮类成分的研究很少。笔者以芦丁和葡萄糖为对照品，采用紫外分光光度计测定大果木姜子中总黄酮、总糖、还原糖、多糖的含量并进行方法学考察，建立测定大果木姜子中总黄酮与糖类成分含量的方法，为进一步完善其质量标准和产品开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1

研究对象。大果木姜子产于贵州省罗甸县，由贵州宏宇药业有限公司提供，经鉴定为樟科植物米槁（Cinnamomum migao H.W.Li）的干燥成熟果实。

1.1.2

主要仪器。HH-W600恒温水箱（江苏金坛市亿通电子有限公司）；科导SK1200H台式超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；SHB-III循环水时多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；101-1AB型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；SZ-93自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）；100 g多功能粉碎机（上海北申科技有限公司）；紫外分光光度计（澳大利亚照生公司）。

1.1.3

主要试剂。对照品芦丁（纯度≥98%，贵州迪大生物科技有限公司，批号0219-201409）；無水葡萄糖（贵州迪大生物科技有限责任公司，批号0209-201402）；甲醇[分析纯，重庆川东化工（集团）有限公司]；乙醇[分析纯，重庆川东化工（集团）有限公司]；石油醚（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）；硝酸铝（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；镁粉（天津市大茂化学试剂厂）；盐酸（重庆川东化工有限公司）；亚硝酸钠（重庆茂业化学试剂有限公司）；氢氧化钠（重庆川东化工有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 大果木姜子中总黄酮的含量测定。

1.2.1.1

对照品溶液的制备。精密称取芦丁对照品，加甲醇制成0.2 mg/mL的溶液，即对照品溶液。

1.2.1.2

供试品溶液的制备。取大果木姜子粉末0.5 g，置于索氏提取器中，用石油醚脱脂处理，脱脂后的粉末置于100 mL圆底烧瓶中，加入80%乙醇45 mL，加热回流40 min，放冷，滤过，重复1次，合并滤液，定容至100 mL容量瓶，即得。

1.2.1.3

标准曲线的绘制。精密量取芦丁对照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL，分别置于25 mL具塞试管，各加80%乙醇补足至5 mL，加入5%亚硝酸钠0.5 mL，静置6 min，加入10%硝酸铝0.5 mL，静置6 min，再加入1 mol/L NaOH 4 mL，静置15 min，此时溶液呈橙红色，以1号管为空白对照，于最大吸收波长（500 nm）处测吸光度，以芦丁对照品溶液的质量浓度（C）为横坐标、吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线，计算得回归方程。

1.2.1.4

样品测定。取不同来源的大果木姜子样品，按“1.2.1.2”方法制备样品溶液，按“1.2.1.3”方法显色并测定显色后吸光度，计算样品中总黄酮含量。

1.2.2

大果木姜子中总糖和还原糖的含量测定。

1.2.2.1

对照品溶液的制备。精密称取葡萄糖对照品25 mg，加蒸馏水制成1 mg/mL的溶液，即对照品溶液。

1.2.2.2

总糖供试品溶液的制备。精密称取样品0.4 g，放入具塞锥形瓶中，加水30 mL，6 mol/L HCl 20 mL，于沸水浴中加热水解40 min，取1滴水解液于白瓷板上，以碘-碘化钾试剂检查，水解液不呈蓝色为水解完全，冷却后加1滴酚酞指示剂以6 mol/L NaOH中和。静置，过滤，并滤至100 mL容量瓶中，残渣以水冲洗，然后定容至刻度，混匀，备用。

1.2.2.3

还原糖供试品溶液的制备。精密称取样品0.4 g于50 mL锥形瓶中，加少量水调成糊状，再加20 mL水，置80 ℃水浴中加熱40 min，然后过滤于25 mL容量瓶中，以水冲洗残渣，定容至刻度。

1.2.2.4

3，5-二硝基水杨酸（DNS）的配制。取1.0 g DNS溶于20 mL 1 mol/L NaOH溶液中，加50 mL水，再加入30 g酒石酸钾钠，溶解后加水稀释定容至100 mL。

1.2.2.5

标准曲线的绘制。精密称取干燥至恒重的无水葡萄糖50 mg于50 mL容量瓶中，加蒸馏水溶解并定容至刻度，混匀，配制成1 mg/mL的标准溶液。取7支试管（分别编号为1～7），按表1加试剂将各管混合均匀，在沸水浴中加热5 min，取出后立即在冷水中冷却，再向各管加入蒸馏水至10 mL，混匀，先使用空白对照除去溶剂的影响，然后再测定葡萄糖溶液的最大吸收波长。于分光光度计483 nm处测定吸光度，并以葡萄糖浓度（C）为横坐标、吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线，计算得回归方程。

1.2.2.6 样品测定。取不同来源大果木姜子样品，按“1.2.2.2”和“1.2.2.3”制备供试品溶液，按“1.2.2.5”方法显色并测定显色后吸光度，计算样品中总糖和还原糖含量。

1.2.3 大果木姜子中多糖的含量测定。

1.2.3.1

对照品溶液的制备。精密称取葡萄糖对照品 25 mg，加蒸馏水制成1 mg/mL的溶液，即对照品溶液。

1.2.3.2

可溶性多糖供试品溶液的制备。精密称取大果木姜子粉末（恒重）1.000 g，置100 mL具塞三角瓶中，每个样品称取2份（2次平行），加入80%乙醇45 mL回流提取，除去黄酮及皂苷、单糖等杂质，再加水45 mL，浸泡30 min，超声30 min，静置过滤，再加入80%乙醇沉淀。重提1次（保存滤渣），2次滤液置100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容。再精密吸取1 mL定容至10 mL，即得。

1.2.3.3

粗多糖供试品溶液的提取。将提取后的滤渣蒸干，加2%HCl 45 mL，置沸水浴中提取l h，充分放冷，滤过后滤液置于100 mL容量瓶中，滤渣重复提取1次，滤过，洗涤滤纸，合并滤液及洗涤液加入到容量瓶中，最后用2%HCl定容至刻度，再精密吸取1 mL定容至10 mL，即得。

1.2.3.4

蒽酮-浓H2SO4的配制。取98% H2SO4 6 mL稀释至100 mL，精密称取蒽酮0.1000 g，放入100 mL容量瓶中，逐渐加入上述配制的H2SO4溶液至刻度并摇匀，冷却至室温，备用。

1.2.3.5

标准曲线的绘制。将葡萄糖置于60 ℃下烘1 h，再逐渐升温至105 ℃干燥至恒重。精密称取5 mg置于25 mL容量瓶中，用蒸馏水溶解并定容至刻度。取5支试管，按表2加试剂。加入显色剂后，于沸水浴中加热10 min，冷却1 h至室温，于625 nm处测定吸光度，并以葡萄糖浓度（C）为横坐標、吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线，计算得回归方程。

1.2.3.6 样品的测定。取不同来源大果木姜子样品，按“1.2.3.2”和“1.2.3.3”制备供试品溶液，按“1.2.3.5”方法显色并测定显色后吸光度，计算样品中多糖含量。根据下列公式计算多糖含量：多糖含量（%）=可溶性多糖含量（%）+粗多糖含量（%）。

2 结果与分析

2.1 大果木姜子中总黄酮含量测定的方法学考察

2.1.1 标准曲线的建立。按照“1.2.1.3”操作，得出回归方程为A=10.559C-0.007 9（r=0.999 1），芦丁浓度在0.009 6～0.067 0 mg/mL的线性关系良好，根据吸光度来计算其含量是可靠的。

2.1.2

精密度试验。精密吸取芦丁对照品溶液1.0 mL于容量瓶中，按“1.2.1.3”方法显色定容后测定，重复6次，RSD为0.82%，表明精密度良好。

2.1.3

重复性试验。精密称取同一样品6份，每份0.5 g，按照“1.2.1.3”方法显色定容后测定，测得样品中总黄酮的平均含量为35.85 mg/g，RSD为2.99%，表明重复性良好。

2.1.4

稳定性试验。精密吸取大果木姜子样品溶液1.0 mL，按照“1.2.1.3”方法显色后放置0、20、40、60、80 min测定吸光度，结果表明，供试品溶液显色后80 min内基本稳定，吸光度的RSD为1.90%，说明样品在80 min内稳定性良好。

2.1.5

回收率试验。精密称定已知含量的大果木姜子粉末6份，每份约0.25 g，置圆底烧瓶中，加入芦丁对照品溶液适量。按“1.2.1.2”方法制备供试品溶液，按照“1.2.1.3”方法显色并测定显色后吸光度，结果发现（表3），大果木姜子黄酮的含量平均加样回收率为98.09%，RSD为2.40%，表明该方法可行。

2.2 大果木姜子中总糖和还原糖含量测定的方法学考察

2.2.1

标準曲线的建立。按照“1.2.2.5”操作，得出回归方程为A=6.091 8C-0.011 4（r=0.999 4），葡萄糖濃度在0.020 6～0.123 7 mg/mL的线性关系良好，根据吸光度来计算其含量是可靠的。

2.2.2

精密度试验。精密吸取葡萄糖对照品溶液1.0 mL于容量瓶中，按照“1.2.2.5”方法显色定容后测定，重复6次，RSD为0.21%，表明精密度良好。

2.2.3

重复性试验。精密称取同一样品6份，每份0.4 g，按照“1.2.2.5”方法显色定容后测定，测得样品中总糖的平均含量为36.13%，RSD为2.30%；还原糖的平均含量为5.92%，RSD为2.30%，表明重复性良好。

2.2.4

稳定性试验。精密吸取总糖、还原糖供试品溶液1 mL于具塞试管中，按照“1.2.2.5”方法显色后放置0、20、40、60、80、100 min测定吸光度，结果表明，供试品溶液显色后100 min内基本稳定，总糖、还原糖的吸光度的RSD分别为2.50%、2.70%，说明样品在100 min内稳定性良好。

2.2.5

回收率试验。精密称取已知含量的大果木姜子样品6份，每份0.2 g，分别精密加入一定量的葡萄糖对照品，按“1.2.2.2”和“1.2.2.3”方法制备供试品溶液，在483 nm处测定吸光度，结果发现（表4～5），大果木姜子中总糖、还原糖的含量平均加样回收率分别为98.65%、98.68%，RSD均为2.80%，表明该方法可行。

2.3 大果木姜子中多糖含量测定的方法学考察

2.3.1

标准曲线的建立。按照“1.2.3.5”操作，得出回归方程为A=12.265C-0.010 1（r=0.999 2），葡萄糖浓度在0.008 0～0.056 1 mg/mL的线性关系良好，根据吸光度来计算其含量是可靠的。

2.3.2

精密度试验。精确吸取葡萄糖对照品溶液1 mL，按照“1.2.3.5”方法显色定容后测定，测定吸光度值，RSD为0.26%，表明仪器的精密度良好。

2.3.3

重复性试验。精密称取同一样品6份，每份1.0 g，按照“1.2.3.5”方法显色定容后测定，测得样品中多糖的平均含量为16.20%，RSD为2.53%，表明重复性良好。

2.3.4

稳定性试验。精确称取样品分别按“1.2.3.2”和“1.2.3.3”制备供试品溶液，按照“1.2.3.5”方法显色后放置0、10、20、30、40、50、60 min测定吸光度，多糖吸光度的RSD为2.05%，表明供试品溶液显色后60 min内基本稳定，说明样品在60 min内稳定性良好。

2.3.5

回收率试验。精密称定已知含量的大果木姜子粉末6份，每份0.5 g，置圆底烧瓶中，加入葡萄糖对照品溶液适量。按“1.2.3.2”和“1.2.3.3”制备供试品溶液，按照“1.2.3.5”方法显色并依法测定显色后吸光度，结果发现（表6），多糖平均加样回收率为97.84%，RSD为2.02%，表明该方法可行。

2.4 样品中黄酮类成分和糖类成分的含量

从表7可看出，大果木姜子中总黄酮、总糖、还原糖、多糖含量分别为（8.02±0.19）mg/g、（35.26±0.96）%、（4.78±0.95）%、（30.53±0.69）%。

3 小结

借鉴前人的方法，以芦丁和葡萄糖为对照品，采用紫外分光光度计测定大果木姜子中总黄酮、总糖、还原糖、多糖的含量，比较样品前处理方法和对照品，绘制标准曲线，并进行方法学考察，建立测定大果木姜子中总黄酮与糖类成分含量的方法。结果表明，大果木姜子中总黄酮含量为（8.02±0.19）mg/g，总糖含量为（35.26±0.96）%，还原糖含量为（4.78±0.95）%，多糖含量为（30.53±0.69）%。该方法快速、简便、准确，可以用于大果木姜子中总黄酮与糖类成分含量的测定，为大果木姜子黄酮和糖类的分析检测及开发利用提供依据，也为完善大果木姜子的质量标准提供借鉴。

参考文献

[1] 李锡文.中国樟科植物志资料（一）[J].植物分类学报，1978，16（2）：90-92.

[2] 邱德文，杜茂瑞.贵州苗药大果木姜子研究及产业化[J].贵州中医学院学报，2003，25（1）：48-51.

[3] 贵州省药品监督管理局.贵州省中药材、民族药材质量标准[S].贵阳：贵州科技出版社，2003：36.

[4] 顾霞敏，许海丹，梁丹霞.马兰叶总黄酮的提取及其含量的测定[J].应用化工，2012，43（2）：281-283.

[5] 谷玉静，史万玉，郝满良.中药多糖免疫作用概述[J].青海畜牧兽医杂志，2012，42（3）：44-45.

[6] 戴玮，肖苏萍，郭凯，等.GC测定苗药大果木姜子中1，8-桉叶素的含量[J].中国现代中药，2013，15（9）：741-743.

[7] 周涛，杨占南，江维克，等.民族药大果木姜子果实挥发油成分的变异及其规律[J].中国中药杂志，2010，35（7）：852-856.

[8] 赵立春，邱明华，邱德文，等.苗药大果木姜子果实挥发油化学成分研究[J].西北药学杂志，2009，24（5）：353-354.