荷丹片对动脉粥样硬化ApoE（-/-）小鼠血清IL-1β和TNF-α表达的影响*

孙龙飞徐风燕葛振嵘沈祥礼安冬青

（1.新疆医科大学附属中医医院，新疆 乌鲁木齐 830000；2.新疆医科大学中医学院，新疆 乌鲁木齐830000；3.新疆名医名方与特色方剂学重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830000）

·研究报告·

荷丹片对动脉粥样硬化ApoE（-/-）小鼠血清IL-1β和TNF-α表达的影响*

孙龙飞1，2徐风燕1葛振嵘1沈祥礼1安冬青2，3△

（1.新疆医科大学附属中医医院，新疆 乌鲁木齐 830000；2.新疆医科大学中医学院，新疆 乌鲁木齐830000；3.新疆名医名方与特色方剂学重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830000）

目的观察荷丹片对载脂蛋白E基因敲除［ApoE（-/-）］小鼠血清中白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达的影响，探讨荷丹片防治动脉粥样硬化（AS）的可能机制。方法48只8周龄ApoE（-/-）小鼠分为正常对照组（12只，给予普通饲料室温饲养），高脂饲料复合气候箱干预组（36只）。喂养12周后，成功复制ApoE（-/-）小鼠动脉粥样硬化秽浊痰阻证模型后，分为3组：模型组、荷丹片组、阿托伐他汀组。12周后处死各组小鼠，采集标本，HE染色光镜下观察主动脉病理学变化，并测定斑块面积（PA）与管腔面积（LA）之比；酶联免疫双抗夹心（ELISA）法检测血清中IL-1β和TNF-α含量。结果模型组主动脉PA/LA比值大于正常对照组（P<0.01），荷丹片组、阿托伐他汀组PA/LA比值则小于模型组（均P<0.01），荷丹片与阿托伐他汀组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。模型组血清中IL-1β和TNF-α表达水平均高于正常对照组（均P<0.01），荷丹片组、阿托伐他汀组血清中IL-1β和TNF-α表达水平均低于模型组（均P<0.01），荷丹片组与阿托伐他汀组比较，差异均无统计学意义（均P>0.05）。结论荷丹片具有防治AS的作用，其机制可能与其降低炎症因子IL-1β和TNF-α的表达，抑制炎症反应有关。

荷丹片 动脉粥样硬化 白细胞介素-1β 肿瘤坏死因子-α

荷丹片是传统调脂中成药，由荷叶、丹参、补骨脂、山楂及番泻叶组方而成，具有升清降浊、化痰祛瘀、补益肝肾之功效，已在临床应用多年，取得了良好的临床疗效。近年来研究表明荷丹片能够减少动脉粥样硬化（AS）的发生率，但其防治AS的机制目前尚不完全明确。课题组在对新疆动脉粥样硬化性疾病的研究过程中，发现荷丹片对新疆特殊的动脉粥样硬化秽浊痰阻证疗效显著，课题组在成功建立动脉粥样硬化秽浊痰阻证动物模型的基础上，进一步研究荷丹片防治AS的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

48只健康雄性，8周龄，体质量16～20 g，C57BL/6J品系，无特定病原体的ApoE（-/-）小鼠，购于北大医学部，许可证号：SCXK（京）2011-0012。饲养于新疆医科大学第一附属医院医学动物实验中心 （已通过《AAALAC International》《实验动物许可证管理办法》和《美国实验动物质量管理办法》认证），本实验通过新疆医科大学第一附属医院动物伦理委员会批准。

1.2 药物与试剂

荷丹片由南昌济顺制药有限公司生产 （批号：20091210），阿托伐他汀片由辉瑞公司生产 （批号：03171，规格20 mg/片），苏木素伊红（HE）染液由新疆医科大学第一附属医院病理科提供；胆固醇 （美国AMRESCO公司）；猪胆盐（上海蓝季科技发展公司）；丙硫氧嘧啶片（RIEMSER Arzneimittel AG公司）；小鼠白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA试剂盒（eBioscience，美国）。

1.3 主要仪器

MIC400人工气候箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；石蜡溶蜡箱，型号PM-401（SAKURA，日本）；组织包埋机，型号5235（SAKURA，日本）；LKB-V切片机（瑞典LKB公司）；自动控温拷片炉（德国莱卡公司）；病理图像分析软件Image-Pro Plus Version 6.0（Ipp6.0）；光学显微镜（LEICA DM 2500德国）；低温高速离心机 （Eppendrof，德国）；多功能酶标仪（Type：1500，Thermo美国）；超净工作台（苏州净化设备厂）。

1.4 分组与造模

将48只8周龄ApoE（-/-）小鼠适应性饲养1周后，分为正常对照组（12只，给予普通饲料室温饲养，温度20～24℃，相对湿度40%～70%），余下36只ApoE（-/-）小鼠给予高脂饲料并放在人工气候箱中饲养［高脂饲料饲养和人工气候箱干预以模拟新疆特殊的饮食习惯及气候特征，将ApoE（-/-）小鼠每天上午10：00时定时放入人工气候箱，晚上21：00时取出放回室温环境］，建立AS秽浊痰阻证模型［1］，喂养12周后，随机从正常对照组抽取2只、造模组抽取6只ApoE（-/-）小鼠，处死，取主动脉根部，HE染色光镜下观察，造模组可见主动脉内膜中膜增厚，平滑肌细胞增生排列紊乱，大量泡沫细胞、巨噬细胞、胆固醇结晶及粥样斑块形成，管腔明显狭窄，ApoE（-/-）小鼠活动明显减弱，对外界刺激反应迟钝，喜静少动，倦怠嗜睡，皮毛干枯无光泽，饮食饮水较正常对照组明显减少，体质量增加不明显，大便呈条形而黏腻，舌质青紫有瘀斑，舌苔厚而浊腻，证实造模组ApoE（-/-）小鼠AS秽浊痰阻证模型已制备成功。将正常对照组剩余的10只ApoE（-/-）小鼠仍作为正常对照组，造模组剩余30只ApoE（-/-）小鼠随机分为模型组、荷丹片组［0.67g/（kg·d）］及阿托伐他汀组［6.1mg/（kg·d）］，每组10只。

1.5 给药方法

药物剂量均根据成人临床常规用量等效换算，小鼠实验用药量 ［g/（kg·d）］=9.1×成人临床用药量［g/（kg·d）］［2］，将药物溶于蒸馏水，灌胃给药，每日1次，每周按体质量调整给药量。正常对照组和模型组均给予蒸馏水灌胃0.2mL/d，各组小鼠均自由饮水饮食，不限制活动。正常对照组继续置于室温，给予普通饲料喂养；模型组、荷丹片组和阿托伐他汀组继续人工气候箱干预及给予高脂饮食（高脂饲料配方：基础饲料72.5%，猪油10%，分析纯10%，猪胆盐0.2%，胆固醇2%，丙硫氧嘧啶片剂0.12%，鸡蛋黄5%，21金维他片剂0.1%）。人工气候箱系统温度设定为（6±2）℃，相对湿度控制在25%～32.8%［3］。

1.6 标本采集与检测

各组ApoE（-/-）小鼠于灌胃第12周末禁食不禁水12 h后，进行以下操作：1）麻醉后摘眼球取血，将置于EP管中，3000 g，4℃，离心10min，分离血清，-80℃保存备检测。2）打开胸腹腔，无菌条件下取主动脉根部至髂肾动脉分支处动脉组织，生理盐水冲洗，在主动脉根部取一段长约0.5 cm，用10%甲醛固定，用于HE染色及斑块面积分析。

1.6.1 HE染色及斑块面积分析 甲醛固定的主动脉组织经脱水、透明、浸蜡、包埋后，进行切片，每个组织连续切片5μm，40张每间5张取1张，共取8张切片；HE染色后在光镜下观察主动脉形态学变化，用Image G多功能图像分析软件进行病理形态学测量分析。计算主动脉斑块面积 （PA）和主动脉管腔面积（LA），测各组ApoE（-/-）小鼠主动脉PA/LA，取PA/LA均值进行统计学分析。

1.6.2 血清中IL-1β、TNF-α水平测定 采用ELISA法检测血清中IL-1β、TNF-α浓度，实验步骤按照试剂盒说明书操作。用酶标仪在450 nm波长处测定各孔吸光度值，以浓度值为横坐标，各标准吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，利用标准曲线计算出相应的浓度值。

1.7 统计学处理

2 结 果

2.1 各组ApoE（-/-）小鼠主动脉病理形态学的变化

见图1。1）正常对照组主动脉内膜中膜见少量平滑肌细胞增生，排列整齐，无泡沫细胞、巨噬细胞形成，炎性细胞浸润不明显，胆固醇结晶形成不明显，管壁几乎无脂质沉积，管腔无明显狭窄。2）模型组主动脉内膜平滑肌细胞增生，排列紊乱，大量泡沫细胞及巨噬细胞形成，炎性细胞浸润，大量胆固醇结晶形成，管壁有脂质沉积，管腔明显狭窄甚至闭塞，斑块与管壁黏附不紧密，有脱落与破裂的斑块。3）荷丹片组主动脉内膜中膜见平滑肌细胞增生，排列紊乱，巨噬细胞形成，炎性细胞浸润，胆固醇结晶形成，管壁脂质沉积，管腔局部狭窄，未见闭塞，病变程度较模型组减轻，斑块与管壁粘附紧密，未见斑块脱落与破裂。4）阿托伐他汀组可见主动脉管壁厚薄不均，中膜、内膜增厚，平滑肌细胞增生，排列紊乱，同样可见有巨噬细胞形成、炎性细胞浸润、胆固醇结晶、脂质沉积，斑块形成，管腔狭窄，未见闭塞，斑块与粘附于管壁，未见斑块脱落与破裂。

图1 各组ApoE（-/-）小鼠主动脉病理形态学变化（HE染色）

2.2 各组ApoE（-/-）小鼠主动脉管腔狭窄程度的比较 见表1。与正常对照组比较，模型组小鼠主动脉PA/LA比值上升（P<0.01），与模型组比较，荷丹片组、阿托伐他汀组的小鼠主动脉PA/LA比值减小 （P< 0.01），荷丹片组与阿托伐他汀组比较，PA/LA比值差异无统计学意义（P>0.05）。

表1 各组ApoE（-/-）小鼠主动脉根部斑块面积/管腔面积比值比较（%，±s）

表1 各组ApoE（-/-）小鼠主动脉根部斑块面积/管腔面积比值比较（%，±s）

与正常对照组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01。下同。

组别 n PA/LA正常对照组 8 0.02±0.01模型组 8 0.67±0.19*荷丹片组 8 0.25±0.1阿托伐他汀组 8 0.26±0.15△

2.3 各组ApoE（-/-）小鼠血清IL-1β和TNF-α表达水平比较

见表2。与正常对照组相比较，模型组IL-1β、TNF-α水平均高于正常对照组（均P<0.01）；与模型组相比较，荷丹片组、阿托伐他汀组IL-1β、TNF-α水平均低于模型组（均P<0.01）；荷丹片组和阿托伐他汀组相比较，荷丹片组IL-1β、TNF-α水平略高于阿托伐他汀组，但差异无统计学意义（均P>0.05）。

表2 各组ApoE（-/-）小鼠血清中IL-1β、TNF-α水平比较（pg/m，±s）

表2 各组ApoE（-/-）小鼠血清中IL-1β、TNF-α水平比较（pg/m，±s）

组别 n IL-1β TNF-α正常对照组 8 12.33±2.09 8.26±5.04模型组 8 35.39±1.56*61.74±8.06*荷丹片组 8 25.14±1.91△28.14±6.74△阿托伐他汀组 8 24.60±1.29△24.24±6.74△

3 讨 论

2015年中国心血管病报告显示［4］，心血管疾病占居民疾病死亡构成的40%以上，为我国居民的首位死因，且患病率及死亡率仍处于上升阶段，成为严重危害人类健康的主要疾病之一。AS是其主要的病理基础，在AS的发生发展的过程中始终存在炎症反应，而炎性因子介导的炎症反应是AS病理形成过程的关键环节之一［5］。早在20世纪末，Ross教授提出了“AS是一种慢性炎症性疾病”的概念［6］。各种炎性细胞因子和炎症介质参与AS的形成与发展［7-8］。白细胞介素-1（IL-1）主要由活化的单核巨噬细胞产生，是一个非常重要的前炎症因子，在炎症免疫损伤机制中起着主要的调节作用［9］，IL-1主要以IL-1α和IL-1β两种不同的分子形式存在，其中IL-1β参与AS的形成和发展［10］。TNF-α具有广泛的生物学活性，是介导炎症反应和免疫反应的重要的前炎症因子，能够调节脂质代谢，并刺激自身及IL-l、IL-6、细胞黏附分子的表达，发挥促炎作用［11-12］，加速AS的形成和发展，在AS病理变化中起到重要作用。因此，通过降低炎性因子表达，抑制炎症反应是防治AS的基本机制之一。

新疆地区动脉粥样硬化性疾病的发病率较我国其他省区偏高，这主要与当地地域气候环境以及居民生活饮食习惯密切相关［13］。本文作者、著名中西医结合心血管专家安冬青教授从上世纪90年代始，针对新疆特殊地域气候环境和居民饮食特点，开展大样本、多中心流行病学调查，运用循证医学的研究方法，总结出秽浊痰阻证是新疆地区动脉粥样硬化性疾病的的主要证型。安冬青教授认为新疆地处我国西北，气候干燥寒冷，居民喜食肥甘厚腻、辛辣烤炙之品。此类食品易使脾胃运化失常，脾虚湿盛，燥伤津液，炼液成痰；痰邪凝结成块，壅滞脉络；寒邪入侵，气机闭塞，则血运不畅，瘀血内生，演变成以脾虚为本，痰瘀湿浊为标的秽浊痰阻证［14］。本研究利用气候箱和高脂饲料干预并成功建立了动脉粥样硬化秽浊痰阻证ApoE（-/-）小鼠动物模型［2］。ApoE（-/-）小鼠由于ApoE基因敲除后，造成血浆含胆固醇丰富的残粒清除受阻，可出现高胆固醇血症，并自发地形成纤维斑块和复合斑块，是进行AS发病机制和防治研究可靠的动物模型。有研究结果显示荷丹片能够治疗动脉粥样硬化性疾病［15-16］。

本研究通过建立动脉粥样硬化秽浊痰阻证动物模型，给予不同干预，研究表明荷丹片能够抑制泡沫细胞及巨噬细胞形成，减轻炎性细胞浸润，抑制斑块形成，减轻管腔狭窄程度，降低血清中炎性因子IL-1β和TNF-α的表达水平，提示荷丹片防治AS机制与其能够调节炎性因子表达，控制炎症反应有关。

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The Effect of Hedan Decoction on the Expression of Interleukin-1βand Tumor Necrosis Factor-αof Atherosclerotic in ApoE（-/-）M ice

SUN Longfei，XU Fengyan，GE Zhenrong，et al. Coronary Care Unit，Af-filiated Hospital of Traditional Chinese Medicine，Xinjiang Medical University，Xinjiang，Urumqi830000，China.

Objective：To observe the effect of Hedan Decoction on the expression of Interleukin-1β（IL-1β）and Tumor necrosis factor-α（TNF-α）in serum in apolipoprotein E gene knock-out［ApoE（-/-）mice］，and to explore the possiblemechanism of Hedan Decoction in the prevention and treatment of atherosclerosis.M ethods：48 ApoE（-/-）mice of 8 weeks’old were divided into two groups：12 ApoE（-/-）mice in the normal control group fed with normal diet，and 36 in the intervention group with high fat diet in artificial climate box.36 ApoE（-/-）mice were fed for 12 weeks to duplicate themodel of atherosclerosis huizhuotanzu syndrome.Thereafter，they were randomized into three groups：themodel group，HDP group and Atorvastatin group.After 12 weeks，themice were killed and the samples were collected.The pathological changes of aorta were observed under lightmicroscope with HE staining，and the ratio of plaque area and lumen area were measured.Serum IL-1βand TNF-α levels were measured by enzyme-linked immunosorbent assay.Results：The ratio of aortic plaque area/lumen area in themodel group was higher than that in the normal control group（P<0.01）.Compared with themodel group，the ratio of aortic plaque area/lumen area in HDP group and atorvastatin group were decreased（P<0.01）；there was no statistically significant difference between HDP group and atorvastatin group（P>0.05）.Levels of serum IL-1βand TNF-αin themodel group were significantly higher than those of the normal control group（P< 0.01）.Compared with model group，serum IL-1βand TNF-αlevels in HDP group and Atorvastatin group reduced obviously（P<0.01）；there was no statistically significant difference between HDP group and atorvastatin group（P>0.05）.Conclusion：Hedan Decoction can prevent atherosclerosis，whosemechanism may be related to the reduction of inflammatory factor IL-1βand TNF-α，so as to reduce the inflammatory response.

Hedan Decoction；Atherosclerosis；Interleukin-1β；Tumor necrosis factor-α

R285.5

A

1004-745X（2017）07-1137-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.07.003

2017-04-15）

国家自然科学基金资助课题（81160428）

△通信作者（电子邮箱：326468701@qq.com）