PLEKHQ1基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞永生化细胞系的建立*

张鹏飞 张 硌* 陆 琤 周晨辰

PLEKHQ1基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞永生化细胞系的建立*

张鹏飞①张 硌①*陆 琤①周晨辰①

目的：建立PLEKHQ1基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)永生化细胞系，为全面研究PLEKHQ1基因功能提供细胞实验材料。方法：采用慢病毒感染的方法将猿猴病毒40(SV40)大T抗原基因导入已鉴定出基因型的MEF中，建立永生化细胞系；利用聚合酶链反应(PCR)检测SV40大T抗原基因在MEF中的整合情况，利用反转录PCR及凝胶成像的方法观察SV40大T抗原基因在MEF中的表达。结果：SV40大T抗原基因已整合至MEF中，且此类MEF已扩大培养及稳定传代半年之久。结论：成功建立的PLEKHQ1基因敲除MEF永生化细胞系，可为进一步研究PLEKHQ1基因功能提供细胞实验材料。

基因PLEKHQ1；SV40大T抗原基因；慢病毒感染；胚胎成纤维细胞；永生化

基因PLEKHQ1(pleckstrin homology domain containing，family Q member 1Q1)，属于含有PH结构域的蛋白超家族，生物信息学分析显示，Q1可能参与细胞因子与受体的相互作用，并且可能在程序性细胞死亡调控过程中发挥作用[1-2]。但目前对其功能的研究尚无专业文献报道。建立永生化的小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts，MEF)系是研究PLEKHQ1基因功能调控的重要基础。由于分离MEF工作量大，原代MEF生存周期短，传代次数有限，因此建立永生化的MEF很有必要，从而为细胞的长期培养和功能研究提供理想的方法和手段。本研究采用慢病毒感染的方法，将猿猴病毒40(simian virus 40，SV40)大T抗原基因导入分离的已鉴定出基因型的MEF中，使其永生化[3]。

1 材料与方法

1.1 材料

(1)质粒与细胞。慢病毒包装质粒PMD、SPA及pCDH-SV40；人胚肾上皮细胞(293T)，均由本研究实验室保存。

(2)实验动物。实验动物为首次怀孕的C57BL/6雌鼠1只，怀孕12.5～14.5 d(怀9只胎鼠)，由军事医学科学院实验动物中心提供，无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级条件饲养。

1.2 仪器与试剂

(1)3111型细胞培养箱(美国Thermo Scientific公司)；CLASS ⅡTYPE A2型超净工作台(北京东联哈尔公司)；C1000 Touch型PCR仪(美国Bio-Rad公司)；Thermo LABOFUGE 400R型低温离心机(美国Thermofisher公司)；DYY-6D型电泳仪(北京市六一仪器厂)；WD-9413B型凝胶成像分析仪(北京市六一仪器厂)。

(2)KOD-FX高成功率聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)酶(日本TOYOBO公司)；高糖培养基(dulbecco's modified eagle medium，DMEM)、胰蛋白酶和磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)均为美国GIBCO公司；胎牛血清(澳大利亚Hyclon公司)；其余试剂均为国产分析纯。Q1引物由上海英俊生物有限公司合成。SV40大T抗原基因引物由北京天一辉远有限公司合成。

1.3 实验方法

1.3.1 小鼠胚胎成纤维细胞的分离及原代培养

细胞分离及原代培养流程为：①取1只为首次怀孕的C57BL/6雌性妊娠小鼠(怀9只胎鼠)，断颈处死；②无菌条件下取出小鼠子宫，分离胎鼠，PBS充分洗涤；③编号，将9只胎鼠的组织剪成约1 mm×1 mm×1 mm大小的组织块，适量的胰蛋白酶消化液，轻轻吹打数次，室温或37 ℃消化3～5 min；④加等体积含血清培养基终止消化，静置3～5 min后收集上层悬液，实验重复操作5次；⑤将15 ml的离心管放入吊篮式离心机中，1000 r/min，离心5 min，培养液[DMBM＋10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)]重悬细胞至培养瓶中，置于37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养；⑥换液，细胞汇合度达80%以上后按1∶3～1∶5传代[4-8]。

1.3.2 原代MEF细胞基因型鉴定

以1～9#小鼠组织MEF细胞为模板，进行PCR。Q1基因引物序列上游引物：GCTCATGGCAACAGCCCTCA；下游引物：GAGCCTTCCAGCCACAGTCTTAGG。扩增产物为283 bp。

PCR扩增反应体系：根据KOD-FX使用说明，按20 μl反应体系进行扩增。PCR反应条件：95 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s、59 ℃退火30 s、68 ℃延伸1 min，循环34次；72 ℃ 5 min终止反应。

1.3.3 SV40大T抗原慢病毒的包装及感染

(1)将PMD、SPA及pCDH-SV40以1∶3∶4的比例与100 μl无血清DMEM混匀，Lipofectamine 2000以2∶1(体积与质粒质量之比)比例与100 μl无血清DMEM混匀，室温孵育5 min后，再将二者混匀，然后室温孵育20 min后，将混合液加入293T细胞中，完成转染。转染8 h后换液，24～36 h后收上清，并将培养皿补至5 ml。约72 h后再次收取上清，3 000 r/min，离心5 min，取上清用0.22 μm滤器过滤后加入超滤管，3000 r/min，离心5 min，得约200 μl浓缩病毒，-40℃保存或立刻使用。

(2)将WT和KO型MEF细胞各铺12孔板的一孔，约104细胞，然后取20 μl的浓缩病毒进行感染，3 d后换液。连续培养10 d后观察SV40大T抗原基因在MEF细胞中的整合及表达情况。

1.3.4 SV40大T抗原基因在MEF细胞中的整合及表达

(1)PCR扩增。以连续培养10 d后的MEF细胞为模板，进行PCR。SV40大T抗原基因上游引物：5'-CGCAGTGAGTTTTTGTTAGA-3'；下游引物：5'-TGTGGTATGGCTGATTATGA-3'。扩增产物为391 bp。PCR反应条件：95 ℃预变性2 min；98℃变性10 s、56 ℃退火30 s、68 ℃延伸1 min，循环34次；72 ℃ 5 min终止反应。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳分析。

(2)反转录PCR分析。提取原代MEF细胞和永生化MEF细胞的RNA，逆转录为cDNA，然后以cDNA为模板，进行PCR。PCR反应体系及条件与鉴定整合情况一致。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳分析。

2 结果

2.1 分离出的MEF细胞基因型鉴定结果

取PCR产物10 μl，加入6×Gel Loading后混匀，进行2%琼脂糖凝胶电泳，并用凝胶成像分析仪进行分析。1 μ9#MEF细胞的基因型如图1所示。

图1 1～9#原代MEF细胞的基因型凝胶成像

其中，1#、2#、3#、5#、6#和8#为杂合型细胞，4#、7#和9#基因型尚需进一步确定。本研究利用变性的方法进行确定，具体如下：分别取已确定为WT和KO基因型的PCR扩增产物各5 μ，然后分别与4#、7#和9#进行95 ℃变性5 min，自然冷却至室温。将上述各样品进行2%琼脂糖凝胶电泳，并利用凝胶成像分析仪进行分析，其结果如图2所示。

图2 4#、7#和9#原代MEF细胞基因型变性后的凝胶成像

由此可以判断4#、7#和9#的基因型分别为：KO、WT和KO，本研究选取了4#和7#进行慢病毒感染，即选取一对WT和KO型MEF细胞进行感染。

2.2 SV40大T抗原基因在MEF细胞中的整合

以质粒pCDH-SV40为模板作阳性对照，原代WT、KO型的MEF细胞为模板作阴性对照，采用PCR扩增的方法，鉴定SV40大T抗原基因在培养10 d后的MEF细胞中的整合情况。对PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，并利用凝胶成像分析仪进行分析。结果如图3所示。

图3 SV40大T抗原基因在MEF细胞中的整合凝胶成像

2.3 SV40大T抗原基因在MEF细胞中的表达

以原代WT、KO型的MEF细胞的cDNA作阳性对照，采用PCR扩增的方法，鉴定SV40大T抗原基因在培养10 d后的MEF细胞中的表达情况。对PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，并利用凝胶成像分析仪进行分析。结果如图4所示。

图4 SV40大T抗原基因在MEF细胞中的表达凝胶成像

3 结论

相关文献及前期实验均已证明：原代培养的MEF细胞增殖能力弱，生长缓慢，生存周期短，极大地限制了对MEF细胞的相关研究。因此，永生化MEF细胞是当前组织工程学领域研究的热点。

SV40是20世纪60年代初从猿猴肾细胞发现并分离出来的病毒，具有转化动物细胞和诱发肿瘤的特性[9]。SV40大T抗原基因目前广泛应用于建立转基因动物模型和永生化各种人类及动物细胞的研究中，导入SV40大T抗原基因能加快转化细胞的生长速率，并保留其原代细胞的许多分化表型[10-13]。

生物信息学分析显示，Q1可能参与细胞因子与受体的相互作用，并且可能在程序性细胞死亡调控中发挥作用。本研究所建立的PLEKHQ1基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞永生化细胞系与原代MEF细胞相比，具有长久传代、稳定连续培养及反复冻存的特点。因此，使用永生化PLEKHQ1基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞系可为PLEKHQ1基因功能的相关研究提供细胞、蛋白质、DNA及RNA样本，并且可减少因个体遗传差异和生理状态等对实验的重复性带来的影响。

本研究利用该方法建立的永生化PLEKHQ1基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞系已稳定传代半年之久，并且在形态结构上与原代细胞无明显差异。

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Establishment of immortalized cell line of mouse embryonic fibroblasts derived from PLEKHQ1 gene knockout mice/

ZHANG Peng-fei, ZHANG Luo, LU Cheng, et al// China Medical Equipment,2017,14(8):158-160.

Objective: To establish an immortalized mouse embryonic fibroblast (MEF) cell line of PLEKHQ1 gene knockout mice in order to comprehensively research function of PLEKHQ1 gene and provide cell experiment materials. Methods: The method of slow virus infection was adopted to transfect gene of simian virus 40(SV40)large T antigen into MEF cell which have been identified genotype to establish an immortalized cell lines. Polymerase chain reaction(PCR)was used to detect the integration of the genome of SV40 large T antigen in the mice embryonic fibroblast cell. Expression of SV40 large T antigen gene in MEF cell was identified by reverse transcription PCR and gel imaging. Results: The mRNA of SV40 T antigen gene has been integrated in cells of the immortalized cell line, and through observation, stable growth and serial propagation of the immortalized MEF cell have achieved for half the year. Conclusion: Successful establishment of the PLEKHQ1 knockout immortalized MEF cell line can provide cell experimental material for further study of PLEKHQ1 function.

PLEKHQ1; SV40 large T antigen; Slow virus infection; Embryonic fibroblast; Immortalization

Department of Medical Engineering, The 307thHospital of PLA, Beijing 100071, China.

1672-8270(2017)08-0158-03

R392-33

A

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2017.08.044

2017-04-31

国家自然科学基金(31400739)“PH结构域蛋白PLEKHQ1协调巨噬细胞迁移与激活的机制研究”

①解放军307医院医学工程科 北京 100071

*通讯作者：marbleluo@126.com

张鹏飞,女,(1984- ),硕士，助理工程师。解放军第307医院医学工程科，从事细胞信号转导研究工作。