活体荧光成像仪用于小鼠细菌感染的监测

吴 涛 周 俊 陈 震 张秋丽 晋 晶 张艳春 史荣辉 付秋霞 詹林盛

活体荧光成像仪用于小鼠细菌感染的监测

吴 涛①周 俊①陈 震①张秋丽①晋 晶①张艳春①史荣辉①付秋霞②詹林盛②

目的：建立一种脓毒血症小鼠模型，对细菌感染情况进行非损伤性成像。方法：采用活体荧光成像仪对发光细菌进行体外成像，通过小鼠尾静脉注射铜绿假单胞菌(典型的革兰氏阴性细菌)诱导脓毒血症建立小鼠模型，利用活体成像分析小鼠体内的细菌感染情况。结果：反映细菌荧光素酶活性的细菌生物发光读数与通过常规计数确定的细菌菌落形成单位(CFU)数呈正相关。细菌感染小鼠的存活率对不同浓度水平的细菌感染有剂量和时间依赖性。结论：活体荧光成像仪可检测细菌生物发光读数，可以应用于监测小鼠感染细菌增殖的变化。

成像；细菌感染；脓毒血症；存活率；监测

铜绿假单胞菌是一种重要的机会性病原体，可在囊性纤维化(cystic fibrosis，CF)或非CF支气管扩张症患者中引起慢性肺部感染[1-3]。研究微生物发病机制的常规模型，通常使用单独的动物组来确定动物的存活率，如半数致死量(lethal dose，LD50)和(或)死亡时间分析，或通过在不同时间点处死动物，计数特定组织的细菌病原体来研究感染过程。相比之下，生物发光成像(bioluminescence imaging，BLI)模型允许从同一动物获得感染和存活的时间和空间分析数据。本研究通过小鼠尾静脉注射铜绿假单胞菌(典型革兰氏阴性细菌)诱导脓毒血症小鼠模型，通过体内成像证实并分析小鼠的感染情况。

1 材料与方法

1.1 实验动物与菌株

(1)实验动物。选用60只雄性C57BL/6小鼠，6～8周龄，体重为18～22 g，购自军事医学科学院实验动物中心，在军事医学科学院实验动物中心无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级条件饲养。其中细菌感染实验小鼠20只，采用随机分组方法分为4组，每组5只；小鼠存活率实验小鼠40只，采用随机分组方法分为4组，每组10只。

(2)菌株。铜绿假单胞菌Xen 13菌株，Perkin-Elmer，Waltham，MA。

1.2 主要仪器与试剂

(1)仪器设备。IVIS 50型活体荧光成像仪(美国Caliper公司)；Spectra Max M5型多功能酶标仪(美国Mocecular Devices公司)；3K15型台式冷冻离心机(美国Sigma公司)；BS210S型电子天平(北京赛多利斯公司)；YT-CJ-2ND超净工作台(北京亚泰科隆公司)；ASV-3023型消毒锅(日本SAKURA公司)；THZ-C型恒温振荡器(江苏太仓市实验设备厂)；MINI型恒温培养箱(北京若比邻电子公司)；BCD-165C型冰箱(韩国三星公司)；Thermo SCIENTIFIC型-80℃超低温冰箱(美国热电公司)。

(2)试剂。LB液体培养基和LB固体培养基(北京化工试剂厂)；磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffer saline，PBS)、异氟烷购自山东科源制药有限公司。

1.3 实验细菌的制备

生物发光的铜绿假单胞菌Xen 13菌株(来源于PerkinElmer公司，Waltham，MA)用于本研究。对于每个实验，将来自冷冻的细菌原种样品接种到新鲜培养基中并生长至对数中期(约3 h)。通过连续稀释和在脑-心浸液琼脂上计数来计数细菌。将细菌用PBS洗涤两次，并基于600 nm处的光密度，重悬细菌于PBS中，获得适当数目的菌落形成单位(colony forming units，CFU)。

1.4 细菌数量的确定

(1)配制LB液体培养基。1 L去离子水中加入胰蛋白胨10 g，氯化钠10 g、酵母提取物5 g，高压灭菌后备用。

(2)配制LB固体培养基。在LB液体培养基中加入1.5%琼脂，高压蒸气消毒，待培养基温度降低后加入抗生素倒平板，置于4 ℃备用。

(3)PBS。1 L去离子水中加入8 g氯化钠、3.628 g磷酸氢二钠、0.2 g氯化钾、0.24 g磷酸二氢钾，盐酸调节pH至7.4，高压灭菌后备用。

(4)配制LB液体、固体培养基与培养皿高压灭菌后，以1%的菌量接种于100 ml培养基中，37 ℃摇床，待其菌液吸光度值在0.5时(约3 h)停止培养。将菌液转移至50 ml灭菌离心管中，4 ℃，以20 cm离心半径、4000 r/min离心15 min。弃上清，加入4 ml培养基及1 ml甘油后，用枪吹打均匀。微量离心管(eppendorf tube，EP)分装1 ml菌液后，置于-80 ℃冰箱冷冻保存。菌液10倍系列稀释，吸取100 μl细菌稀释液涂板进行培养。根据1个OD 600(600 nm波长时的吸光度OD值)＝1～3×108细胞/ml推算约略所需要的稀释度，以便在取用0.1 ml的稀释液涂抹在LB平板时，可得到菌落数为30～300 cfu。

1.5 发光细菌的体外成像

吸取菌液200 μl至酶标板中，重复3孔。PBS 200 μl加入酶标板的细菌原液孔中，用PBS进行倍比稀释，每份菌液共计8孔。使用成像仪对发光细菌进行体外成像。

1.6 细菌感染

将4组20只细菌感染实验小鼠(每组5只)用小鼠固定器固定，用吸取细菌溶液的注射器经其尾静脉注射细菌200 μl，感染每只实验小鼠。注射结束后将小鼠放回笼中继续饲养。

1.7 小动物活体成像

用1%～3%异氟烷麻醉小鼠至停止活动后，将其放入活体成像仪中，打开麻醉气体开关，并保持1%～2%的异氟烷持续麻醉。根据注射细菌数量不同，选取自动活体成像模式，1～5 min不等，成像结束后，将实验动物放回动物饲养箱中。

1.8 小鼠存活率

将4组40只存活率实验小鼠(每组10只)分别通过其尾静脉注射5×107cfus/ml、1×108cfus/ml、1.5×108cfus/ml和2×108cfus/ml不同浓度的细菌200 μl，感染实验小鼠。细菌注射后72 h观察每组小鼠的存活数量，计算小鼠存活率。

1.9 统计学方法

采用SPSS17.0统计学软件进行数据分析，定量资料用均数±标准差(x-±s)表示。两组数据进行比较时采用t检验。多组间进行比较时：若组间方差齐时，采用单因素多水平设计定量资料方差分析(ANOVA)；组间方差不齐时，采用非参数检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细菌体外成像

为了非侵入性地对细菌感染进行成像，采用生物发光的铜绿假单胞菌Xen 13菌株。首先对细菌进行体外成像，以证实荧光素酶活性与细菌数目成正相关(如图1所示)。

图1 不同CFU数量的细菌荧光素酶活性的体外成像

注：倍比稀释后不同数量细菌200 μL加入酶标板进行成像，探讨荧光素酶活性与细菌CFU数目的关系。

2.2 活体荧光成像监测铜绿假单胞菌在小鼠体内的感染

生物发光强度与通过常规计数确定的细菌CFUs数相关，表明生物发光成像可用于监测细菌存活的变化(如图2所示)。

图2 小鼠注射不同CFU数量的细菌后24 h的生物发光成像

2.3 铜绿假单胞菌感染数量与死亡率相关

在每只感染1×107，2×107，3×107或4×107CFUs铜绿假单胞菌的小鼠中，死亡率有剂量和时间依赖性；4×107CFU组中的所有(100%)小鼠在感染后24 h死亡，而3×107CFU组中的小鼠在感染后24 h或48 h死亡(80%)，在2×107CFU组中的小鼠在感染后24 h(20%)死亡。1×107CFU组中的所有小鼠存活至实验结束，如图3所示。

图3 不同CFU数量的细菌注射小鼠72 h后的存活曲线图

3 讨论

临床中一旦确定为慢性感染，尽管频繁使用抗生素治疗，铜绿假单胞菌菌株仍可以保留在患者的肺中。铜绿假单胞菌感染具有高病死率，经常导致弥散性感染，引起菌血症及脓毒性休克[4-5]。为更好地观察铜绿假单胞菌感染小鼠后在不同器官中的积聚及生物分布情况，本研究从小鼠尾静脉注射发光细菌，通过体内BLI分析荧光素酶阳性的器官，并确定肝脏是铜绿假单胞菌集聚的主要器官。BLI是一种用于检测小型哺乳动物内部发光细胞的方法。通过BLI可以非侵入性方式描述和研究宿主体内病毒、寄生虫和细菌病原体的传播。目前，BLI正在成为一种用于研究药物诱导的肝毒性、感染的免疫反应和对活体动物治疗效果进行量化的有效技术[6-8]。同一组动物可以在感染过程中根据需要的时间进行成像。BLI模型的潜在优点是：①研究所需的动物数量更少；②随着时间的推移，具有在同一动物中跟踪疾病过程的能力；③潜在识别意外的传播途径[9-11]。病原体在感染的动物体内发光，采用可检测极少量光的高灵敏度照相机对其进行成像[12-13]。

在本研究中，非发光的绿脓杆菌可以被遗传修饰以表达lux基因(luxCDABE)，成为可检测信号的工程微生物，通过生物发光产生光的细菌luxCDABE操纵子适合在许多种细菌中用作生物报告物。与真核荧光素酶系统不同，luxCDABE操纵子编码细菌荧光素酶和产生荧光素酶底物所必需的其他酶，消除了对发光需补充外源底物的要求。在氧的存在下，荧光素酶催化反应，产生光作为副产物。由组成型启动子驱动的luxCDABE报告分子，其中细菌密度与发光直接相关，提供了监测绿脓杆菌生长的手段。此外，由于生物发光仅由活细菌产生，因此细菌存活也可以用luxCDABE报告物监测。在不添加底物或灭活细菌的情况下检测来自luxCDABE的生物发光信号，使其成为用于实时监测细菌和高通量生物技术的理想报告物[14-16]。发光细菌的体外成像证实，细菌的荧光素酶活性与细菌的数目呈正相关。采用铜绿假单胞菌的细菌感染进行非侵入性成像。

本研究建立了脓毒血症小鼠模型。通过体内成像分析小鼠的细菌感染情况。细菌的生物发光读数与通过常规计数确定的细菌数相关，表明活体荧光成像仪可以应用于监测细菌存活的变化。

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The monitoring for mice with bacterial infection by using vivo fluorescence imager/

WU Tao, ZHOU Jun, CHEN Zhen, et al//China Medical Equipment,2017,14(8):161-164.

Objective: To establish a mouse model of sepsis and execute noninvasive imaging for mouse of bacterial infection. Methods: In vivo fluorescence imager was applied to achieve vitro imaging for luminous bacteria, and Pseudomonas aeruginosa (typical Gram-negative bacteria) was injected through tail vein to induce septicopyemia for establishing mouse model. And then, The bacterial infection of the mice were analyzed by using vivo imaging technique. Results: Bacterial bioluminescence readings which could reflect the activity of bacterial luciferase were positively correlated with bacterial colony forming units (CFU) which were confirmed through routine counting. The survival rate of infected mice depended on dose and time of bacterial infection of various concentration. Conclusion: In vivo fluorescence imager can detect bacterial bioluminescence readings and it can be used to monitor the changes of bacterial propagation for infected mice.

Imaging; Bacterial infection; Sepsis; Survival rate; Monitoring

Department of Blood Transfusion, Land Force General Hospital of PLA, Beijing, 100700 China.

1672-8270(2017)08-0161-04

R-331

A

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2017.08.045

2017-03-19

①陆军总医院输血科 北京 100700

②军事医学科学院血液免疫室 北京 100850

吴涛,男,(1971- ),博士，副主任技师。陆军总医院输血科，从事临床输血研究工作。