Gefitinib与5-FU、CDDP及X线联合应用对OSCC离体细胞抑制效果的研究①

王心彧， 关 键，孙国姝，李德超

(1.佳木斯大学附属第二医院，黑龙江 佳木斯 154002；2.佳木斯市口腔病防治院，黑龙江 佳木斯 154002)

Gefitinib与5-FU、CDDP及X线联合应用对OSCC离体细胞抑制效果的研究①

王心彧1， 关 键1，孙国姝2，李德超1

(1.佳木斯大学附属第二医院，黑龙江 佳木斯 154002；2.佳木斯市口腔病防治院，黑龙江 佳木斯 154002)

目的：研究吉非替尼(gefitinib)与5-氟尿嘧啶(5-FU)、顺铂(CDDP)联合作用于口腔鳞状细胞癌(OSCC)体外培养细胞株与单一作用对鳞癌细胞抑制强度有无差别，及差别程度；研究吉非替尼与放射线共同作用对口腔鳞癌离体细胞灭活作用与单一放射线作用的差别。方法：①将3例口腔鳞状细胞癌患者手术切除的肿瘤组织进行离体细胞培养，传代稳定后加入96孔板分组加药，分为A、B、C、D、E五组，每组3复孔，各组分别加5-FU、CDDP、gefitinib、getitinib+5-Fu、gefitinib+CDDP。37℃、5%CO2孵育24h，MTT法检测各组吸光值，计算各组抑制情况进行组间比较。②将三种细胞每种分为对照组、X线组、吉非替尼组和吉非替尼+X线组，计数后分别加入6cm培养皿1×106个/皿(每组设置3皿重复)，孵育24h，吉非替尼组及吉非替尼+X线组加入含2.5μL的DMEM 5mL其余组更换DMEM后继续培养24h，在达到12h后X线组接吉非替尼组+X线组给予8Gy X线照射后继续孵育12h后进行MTT检测。结果：①D、E两组细胞抑制效果明显好于A、B、C三组。分别统计各组组间差异性，经检验：OSCC1: AD组:P<0.01、BE组:P<0.01、CD组:P<0.01、CE组:P<0.05；OSCC2: AD组:P<0.01、BE组:P<0.05、CD组:P<0.05、CE组:P<0.01；OSCC3: AD组:P<0.05、BE组:P<0.05、CD组:P<0.05、CE组:P<0.01。各配对组间统计均有统计学意义。②Gefitinib与X线联合应用后对各组鳞癌细胞灭活作用显著增强，对照吉非替尼组，去除药物本身对鳞癌细胞抑制作用影响后，经统计学计算吉非替尼对X线放射有增敏作用。结论：Gefitinib作为表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂，单独作用于口腔鳞癌细胞有抑制细胞生长的作用，但与细胞毒类化疗药物5-FU，重金属类化合物化疗药物CDDP以及常规X线放射治疗方法联合时则能较大提高放化疗药物敏感性。为临床联合用药提供实验依据。

吉非替尼；5-氟尿嘧啶；顺铂；放射线；联合作用；口腔鳞状细胞癌

口腔鳞状细胞癌(OSCC)目前采用手术结合术后化疗治疗为主，化疗药物常见的有5-FU、CDDP及平阳霉素等，放射治疗以X线照射为主。目前对于表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸酶抑制剂Gefitinib的研究主要集中在肺部非小细胞肺癌临床化疗治疗中。有实验证明，在口腔鳞状细胞癌体外培养细胞EGFR有不同程度表达[1,2]，单纯应用吉非替尼对口腔鳞癌细胞有抑制作用。本实验通过对临床手术OSCC患者手术切除肿瘤瘤体癌细胞体外培养细胞株分别加入Gefitinib、5-FU、CDDP以及Gefitinib与其他两种药物配伍应用；吉非替尼与X线联合应用，观察各种方式对细胞株的抑制作用。为临床化疗的联合用药及放化疗结合提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

OSCC患者手术切除新鲜肿瘤组织、低糖DMEM(达尔伯克必需基本培养基)、吉非替尼(商品名：易瑞沙 Iressa)、5-氟尿嘧啶、顺铂、MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝)、超净工作台、CO2恒温箱、分光光度计。

1.2 实验方法

1.2.1 人口腔鳞癌细胞培养

选取三名术前病理诊断为鳞癌患者新鲜切除肿瘤瘤体中外部部分肿瘤组织，置入内含0.9%氯化钠注射液的无菌病理袋内，带至实验室，在超净工作台内将肿瘤组织用灭菌双蒸水冲洗3次后剪碎置入微试管，PBS反复吹打洗净切面血液后小心弃液，加入0.1%Ⅱ型胶原酶液500μL，37 ℃培养箱内消化1h，反复吹打后取上层消化液1000rpm离心10min，弃上清液PBS混匀后离心，反复4次后弃上清液，DMEM 1mL混匀后接种于6cm直径含5ml DMEM的培养皿中，置于37℃培养箱中培养[3]。

1.2.2 成纤维细胞的排除

本实验去除成纤维细胞采用反复贴壁法[4]：待细胞生长到一定数目时弃去培养液，0.01%胰蛋白酶(trypsin)消化后PBS冲洗2次，离心后弃上清，加DMEM 1mL混匀。取标号为1、2、3的培养皿，将该液置入1号内，入恒温箱孵育10min后拿出，轻摇后全部吸出培养液，置入2号，恒温箱孵育10min，同时向1号皿加5mL DMEM 继续培养。如上方法将2号皿内液体置入3号，同时继续培养。24h后观察，3号皿内为较纯净癌细胞[5]。

1.2.3 细胞培养及分组

37℃、5%CO2将纯净癌细胞传至第5代时，进行分组：A组：5-FU组、B组： CDDP组、C组： Gefitinib组、D组：Gefitinib+5-FU组、E组：Gefitinib+CDDP组。后进行细胞计数并接种至96孔板，密度1×105/孔，每组设置3复孔，同时设置空白对照组，培养24h。

1.2.4 细胞加药

分别与DMEM配置5-FU 1mM/L、CDDP 500μM/L；取成品易瑞沙(Iressa)无菌研磨后配制成100μM/mL。按照5-FU 6nM/孔、CDDP 3nM/孔、Gefitinib 300nM/孔[6]，加入前三组，按与前三孔相同数量配伍后对应加入后两孔，每孔内加DMEM 至200μL，置入恒温箱孵育24h。

1.2.5 MTT法检测

弃去各孔内液，每孔加入150μL DMEM，后加0.5%MTT 50μL 继续孵育4h后，弃去液体，每孔加二甲基亚砜(DMSO)150μL ,置摇床上低速震荡10min，在分光光度计570nm处测量各孔的吸光值(A)。

1.2.6 放射线实验

将细胞计数后接种于6cm培养皿中，每细胞接种四组(A对照组、B单纯放射组、C吉非替尼组，D吉非替尼+放射组)，每组三皿， 5×106个/皿，培养24h后C、D组中加入含Gefitinib 0.3μM/mL的DMEM 5mL，A、B两组更换培养液后继续培养，孵育24h。 B、D两组在孵育12h时一同进行8Gy 6mV X线照射后继续孵育12h，弃去原培养液后将各组细胞消化后移至试管，离心后5mL DMEM 充分混匀按100μL/孔加入96孔板后每孔填加DMEM100μL后继续培养24h后MTT法检测各孔吸光值[7]。

1.3 统计学方法

采用SPSS16.0软件对各组抑制效果组间用t检验。整个实验重复3次，取每次每组3复孔以对照组吸光值为单位进行标准化，取得平均值，进行标准差分析。

2 结果

2.1 化疗

经化疗后，经测定其吸光度来检测各类化疗方法对鳞癌细胞的影响效果，见表1。经统计比较后发现，5-FU联合Gefitinib及CDDP联合Gefitinib对鳞癌细胞的抑制作用显著优于单用药物(P<0.05)。

表1 化疗后各组细胞吸光度平均值a

a：各组值均为重复测量三次后取平均值

b：A组与D组两组间比较(P<0.05)，两组间具有统计学差异。c：B组与E组两组间比较(P<0.05)，两组间具有统计学差异。d：C组与D组两组间比较(P<0.05)，两组间具有统计学差异。e：C组与E组两组间比较(P<0.05)，两组间具有统计学差异。

2.2 放疗

经放疗后，经测定其吸光度来检测各类放疗方法对鳞癌细胞的影响效果，见表2。经统计比较后发现，X射线放射联合Gefitinib治疗对鳞癌细胞的抑制作用显著优于单用X线放射治疗(P<0.05)。

表2 放疗后各组细胞吸光度平均值a

a：各组值均为重复测量三次后取平均值；b：X+G组与单纯X线组比较(P<0.05)，两组间具有统计学差异。

3 讨论

有实验证明Gefitinib对鳞癌细胞有抑制生长的作用，吉非替尼是一种选择性表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂，该酶通常表达于上皮来源的实体瘤。对于EGFR酪氨酸激酶活性的抑制可妨碍肿瘤的生长，转移和血管生成，并增加肿瘤细胞的凋亡。在体内，吉非替尼广泛抑制异种移植于裸鼠的人肿瘤细胞衍生系的肿瘤生长，并提高化疗、放疗及激素治疗的抗肿瘤活性[8]。在临床实验中已证实吉非替尼对局部晚期或转移性非小细胞肺癌具客观的抗肿瘤反应并可改善疾病相关的症状。而5-FU及CDDP是在临床上比较常用的治疗口腔鳞状细胞癌化疗用药[9，10]，X线照射也是常规放疗方法。本实验结果表明两种药物通过与吉非替尼联合应用，作用于鳞癌细胞后效果均好于单独应用，统计学显示各关系组组间对照结果显示起到超相加效应(P<0.05)。联合治疗疗效评价采用细胞存活分数(SF)和AUC率的比较分析，比较分析采用t检验。药物剂量对超相加作用的影响采用单因素方差分析(ANOVA)。Gefitinib联合放疗疗效及Gefitinib联合化疗(5-FU、CDDP)放疗的疗效评价采用“相加效应，(P>0.05)即药物+放疗(或放化疗)的附加效应;“超相加效应”(P<0.05)即大于药物+放疗(或放化疗)的附加效应亦即协同效应。通过该结果我们分析5-FU为细胞毒类化疗药物，CDDP属于重金属类化疗药物，而Gefitinib选择性的抑制EGFR，其作用于细胞位置不同能够起到相加作用(P<0.05)，而Gefitinib选择性抑制EGFR后能否增加5-FU、CDDP及X线作用强度还需进一步实验证实。因此，联合应用对口腔鳞癌细胞抑制效果是肯定的。另外各样本细胞对照的不均等性与该鳞癌细胞EGFR表达从本次实验结果看成正相关性，具体表达量与抑制强度增幅作用之间的关系也还需要进一步实验证明。

综上所述，由于EGFR靶向抑制剂Gefitinib和传统抗癌放化疗治疗是通过不同细胞毒机制来发挥作用，因此在两者联合治疗提高疗效的同时，并没有治疗所带来的毒性叠加作用，这一理论为联合治疗提供了很好的治疗前景。

[1]杨文军,林兆全,李良忠,等.VEGF、EGFR、p16在唇癌与口腔鳞癌中的表达及意义[J].Chin J Stomatol, March，2002,37,2

[2]陈富林. 表皮生长因子受体与头颈部鳞癌[J].国外医学.口腔医学分册,1995,(5)：1316

[3]Zimme M,Zouhair A,Azria D,et al.The epidermal growth factor receptor(EGFR) in head and neck cancer:its role and treatment implications.Radiat Oncol，2006， may 2;1:11

[4]刘玉琴.细胞培养实验手册[M].北京:人民军医出版社,2009,47-102

[5]RantanenV，GrenmanS，KulmalaJ，et al. Comparative evaluation of eisplation and carboplatin sensitivity in endometrial adenoeareinoma cell lines[J].Br J Caneer，1994，69:482-486

[6]OehsJS.Rationale and elinieal basis fo reombining gefitinib (IRESSA，ZD1839) with radiation therapy for solid tumors[J].Int J Radiat Oncol BiolPhys，2004，58(3):941-949

[7]Sok JC,CoPPelli FM,Thomas SM,et al.Mutant Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR vⅢ) contributes to head and neck cancer growth and resistance to EGFR targeting[J].Clin Cancer Res，2006，12(17):5064-5073

[8]杨键, 张国梁, 关键. 口腔鳞癌组织中TLR4及NF-κB p65的表达和意义[J]. 黑龙江医药科学, 2016, 39(2):47-49

[9]李鹤佳, 刘树发. 5-氟尿嘧啶对口腔鳞癌细胞株热休克蛋白27/70表达的影响[J]. 黑龙江医药科学, 2009, 32(1):34-36

[10]朱世滨, 梁怀祝. MTT法分析5-氟尿嘧啶缓释微球的体外细胞毒作用[J]. 黑龙江医药科学, 2006, 29(2):59-60

Highlights:Objective: To investigate the difference and the degree of the difference between the single effect of deitinib (gefitinib), 5- fluorouracil (5-FU), cisplatin (CDDP) and the combination of three drugs to oral squamous cell carcinoma (OSCC) cell lines in vitro; to compare the difference between the somatic inactivation effect of gefitinib combined with radiation and the single effect of gefitinib to OSCC. Methods:①OSCC cells were available from the fresh tumor tissue of 3 carcinoma patients. Cells were cultured and stable passage. Cells were added into 96 hole plate and divided into 5 groups. 5-FU, CDDP, gefitinib, gefitinib plus 5-gu, and gefitinib plus CDDP was applied to the cells of each group respectively. MTT assay was used to measure and compare the inhibitory effect of the drugs. ②Cells were divided into control group, x-ray group, gefitinib group, x-ray plus gefitinib group. Cells were counted and added into 6cm dish and incubated for 24h. 5ml DMEM was added to gefitinib group and gefitinib+x-ray group. The other two groups remained cultured 24h after replacement of DMEM. 8Gy x-ray was applied to cells of x-ray group and gefitinib+x-ray group. MTT assay was used to detect the survival rate of the cells after 12h incubation. Result:①Group D and E cells had better inhibitory effect than the other groups. The statistics significant difference between each 2 groups were as follows: OSCC1: group A and D:P<0.01; group B and E:P<0.01; group C and D :P<0.01; group C and E:P<0.05; OSCC2: group A and D:P<0.01; group B and E:P<0.05; group C and D:P<0.05; group C and E:P<0.01；OSCC3: group A and D:P<0.05; group B and E:P<0.05; group C and D:P<0.05; group C and E:P<0.01.Each matched groups has statistical significance. ②Gefitinib and x-ray joint application enhanced deactivation of OSCC cells. Gefitinib had the ability to increase the sensitization of x-ray by statistics calculation after removal the inhibitive influence of gefitinib. Conclusion: As a epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor, Gefitinib can inhibit the growth of OSCC cells. Moreover, Gefitinib combined with 5-FU CDDP and conventional X-ray radiation therapy can improve the sensitivity of chemotherapy and radiotherapy.

Study on the inhibitive effect of Gefitinib combined with 5-FU,CDDP and X-ray to OSCC cells

WANGXin-yu1,GUANGJian1,SUNGuo-shu2,LIDe-chao1

(1.The Department of Oral Surgery of Stomatology Hospital of Jiamusi University,Jiamusi 154002,China；2.Oral Department of Jiamusi Centro-Hospital,Jiamusi 154004,China)

Gefitinib; 5-FU; CDDP; joint action; OSCC

佳木斯大学自然科学面上项目，编号：S2011-044。

王心彧 (1980～)男，黑龙江齐齐哈尔人，硕士，主治医师。

R445.4

B

1008-0104(2017)04-0043-03

2017-03-14)