骨髓间充质干细胞对大鼠急性胰腺炎的治疗①

石 慧,艾迎春,刘 敏

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

骨髓间充质干细胞对大鼠急性胰腺炎的治疗①

石 慧,艾迎春,刘 敏

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

目的:研究骨髓间充质干细胞对大鼠急性胰腺炎的治疗效果。方法:实验分为正常对照组，AP组，移植组。用L-精氨酸建立大鼠急性胰腺炎模型，行骨髓间充质干细胞移植术，运用全自动生化分析仪检测12h、24h、48h、72h血清脂肪酶含量；标本病理评分分析病变；采用免疫组化法测定胰腺中MMP-9、NF-KB的定位与定量。结果:12h、24h、48h、72h移植组血脂肪酶含量、病理评分、胰腺组织中MMP-9、NF-KB表达均显著低于AP组，差别有统计学意义(P<0.05)，但移植组高于正常组，差别有统计学意义(P<0.05)。结论:骨髓间充质干细胞对大鼠急性胰腺炎有缓解治疗作用，发病机理阐述不详尽。

骨髓间充质干细胞； 急性胰腺炎； 血淀粉酶； MMP-9；NF-KB

急性胰腺炎的发病率呈逐渐上升，死亡率呈稳定趋势。轻者胰腺充血、水肿为主，常自限。重者胰腺出血、坏死，易发生腹水、休克、腹腔感染、MODS等多种伴发症，死亡率高。胰腺的腺泡损伤、被激活的单核巨噬细胞与具有活性胰酶的释放，促使中性粒细胞产生大量的炎性物质，这些大量的炎性物质能够引起微循环的障碍与胰腺血管通透性增高，使得胰腺发生炎症及坏死[1]。MMP- 9作为一种炎症级联效应的下游靶分子出现,它对许多促炎因子发挥正反馈调节功能,是炎症反应重要的蛋白分子，同时它与胰腺炎的严重程度成比例，与病情的预后有着密不可分的联系。NF-KB是一种介导炎症应答的起始因子，在胰腺炎的病理过程中参与全程，对它的研究是应用于每个研究阶段。急性胰腺炎属于一种炎症性疾病，能够有效地抑制炎症反应，是解决本病的重要步骤。骨髓间充质干细胞在组织炎症损伤与修复的过程在临床中起到先导的作用。而且，近期大量资料报道，骨髓间充质干细胞具有旁分泌作用，通过分泌的因子，可以有效地减轻胰腺炎的病变程度，对于胰腺炎是一种新的治疗治疗手段，为本病的治疗开辟了一个新的研究渠道，让我们更深刻的、更综合的了解、认识细胞的多种功能，从而对疾病有全面的理解。

1 材料与方法

1．1 材料

60只健康级SD雄鼠，体重约200g，选自佳木斯大学动物实验中心，选择全自动生化分析仪，MMP-9、NF-KB的相应一抗、二抗试剂。

1．2 方法

将60只大鼠随机分成3组，每组20只，采用L-精氨酸分别3次腹腔注射，间隔1h，制备AP模型。选取出生14d小鼠，选择第3代小鼠骨髓间充质干细胞制成单细胞悬液，浓度为1mL/只，造模成功后，在移植组大鼠的尾静脉处注入细胞悬液，观察大鼠的一般状态如精神状态、活动程度、饮食情况，于12h、24h、48h、72h，分别取每组大鼠中5只进行实验，以10%水合氯醛左下腹皮下注射麻醉，麻醉成功后，在左心室部位采集血液3mL，将血样离心提取到EP管并在-20℃冰箱中储存，必要时测定血脂肪酶，同时分离、提取胰腺组织，放于10%甲醛溶液中固定，以备用于HE、免疫组化等相关试验。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 3组不同阶段血脂肪酶

移植组较AP组降低。由表可知，骨髓间充质干细胞对血脂肪酶有一定的影响作用，但是资料显示，血脂肪酶变化较快，不易检测，因此，对于胰腺炎的诊断存在困难，不能准确代表胰腺炎的病变，意义不显著。同时也说明骨髓间充质干细胞对血脂肪酶含量有一定的影响作用，但是机制目前研究不明确，而且意义阐述不明确。见表1。

表1 血脂肪酶含量

2.2 3组不同阶段胰腺病理评分

在各个水平时间段移植组均低于AP组P<0.05，差别有统计学意义。但比正常组高，可见移植组未达到正常水平，见表2。

2.3 3组不同阶段组织MMP-9、NF-KB

移植组MMP-9、NF-KB的表达较AP组低，AP组较正常组高，移植组比正常组高，见图1。

表2 病理评分，分)

图1 3组不同阶段组织MMP-9、NF-KB：移植组MMP-9、NF-KB的表达

3 讨论

实验从三个方面探究骨髓间充质干细胞对大鼠急性胰腺炎的治疗作用，从三大方向进行分析，在这些方面(P<0.05)，差别有统计学意义，移植组可以显著降低血酶学指标、炎症因子和减轻病变，有一定保护治疗作用。最新研究显示，血脂肪酶的特异性优于血淀粉酶，更能进一步反应胰腺炎的病理变化，本蛋白酶随着病情的发展能稳定的表达，不仅可以反应病变的程度，更是评判胰腺炎发生的首选指标，具有易测性、特异性。实验中移植组可以显著降低它的含量，说明细胞可以将其抑制，减轻胰腺的过度损伤。病理分析见在每个阶段移植组病理评分低于AP组(P<0.05)，差别有统计学意义，移植组可明显减低病理评分，说明它对胰腺的破坏效应微弱，甚至起到保护修护作用，但机理不详尽。MMP-9可以有效的评估急性胰腺炎的病变程度，此指标在胰腺炎的炎症反应中发挥重要的作用，对以后胰腺炎的发生、发展意义不可忽视，有着重要的实用价值，而且是近几年研究的新因子，其本质是炎症性因子，对胰腺炎的炎症反应病程中扮演着重要的角色。因此，有效的抑制MMP-9的表达，可抑制炎症反应，可能在全身炎症反应中起到一定的应用价值。近年的研究发现在心衰大鼠中MMP-9表达增加，间充质细胞移植可降低MMP-9在心衰大鼠心肌中表达[2，3]。可能间充质干细胞分泌多种细胞因子影响炎性细胞因子生成, 改变基质金属蛋白酶-9分泌和活性阻止胶原蛋白网被降解,促进细胞外基质的合成,增加胶原沉积和纤维化,改变基质重构,有利于心功能改善[4]。同时，本实验移植组的MMP-9在胰腺组织中的定位表达及含量均明显低于急性胰腺炎组，说明骨髓间充质干细胞对MMP-9 有调控、抑制作用，可以减轻炎症反应，避免对胰腺组织、细胞、间质的进一步损害，阻碍疾病的快速进展，发生机制可能与细胞的旁分泌有关系，但是具体是何种细胞因子、介质，何种复杂细胞网络的建立相关文献报道少见，将是我们接下来研究的重点课题。NF-KB在胰腺炎中呈现高度表达，并与一系列细胞因子相互作用，在胰腺炎的发生、发展中占据着主导地位，国内外文献报道见，在骨髓间充质干细胞干预对高氧肺损伤新生大鼠核转录因子-KB和血小板内皮细胞黏附分子-1表达的影响的文章中提示 BMSCs 可抑制 NF-κB 的活化，减轻炎症反应，促进高氧肺损伤的修复[5]。实验证明，骨髓间充质干细胞可分泌IL-10、白介素-1受体拮抗剂和可溶性肿瘤坏死因子受体等多种抗炎介质。NF-KB是被公认的IL-10的主要胞内受体，同时IL-10支配着它的激活。目前文章显示，IL-10可以有效降低NF-KB的含量，对其有控制效果，由此可见，骨髓间充质干细胞通过旁分泌发挥治疗作用毋庸置疑。综上所述，骨髓间充质干细胞对大鼠急性胰腺炎有一定的治疗作用，可引起该指标明显降低，上述指标在炎症发展中起着至关重要的作用，可以有效将其抑制，阻断了炎症进展，减少组织及周围邻近器官的损伤，起到保护修复作用，预防发生全身炎症反应综合征，避免发生多器官功能障碍甚至衰竭，降低病人死亡率。骨髓间充质干细胞对上述指标的影响，可能是因为其特有的旁分泌作用机制，分泌的因子发挥其抑制作用，使指标明显降低，其发病机制仍是今后研究的重点内容。图3见AP时MMP-9、NF-KB易定位于胰腺细胞及间质，胞质中棕褐色呈强阳性，移植组有所变淡、含量减少。说明移植组的阳性率表达较AP组明显降低，但尚未恢复正常水平。间充质干细胞除了很强的自我增殖及多向分化潜能而具有促进损伤组织再生修复能力外，还显示出较强的抗炎能力。间充质干细胞的旁分泌作用，说明了此细胞的另一作用机制，调控免疫炎症反应，但机制阐述不明。干细胞易发生癌变，细胞的移植存在免疫排斥反应，存在伦理道德问题等一系列的约束与限制，因而用于临床受到极大挑战，骨髓间充质干细胞治疗炎性疾病技术仍处于动物研究层面，而且它的旁分泌作用目前成为研究的热点，可以有效地解决细胞移植等一系列问题，在未来的日子里将是治疗急性胰腺炎的一种最优选择，但是存在一些弊端仍需要解决，是以后日子里遇到的最大挑战。

[1]田桦，邵艳艳，卓越.急性胰腺炎患者血清IL-1β和TNF-α的水平变化的研究[J]．黑龙江医药科学,2008，31(3):72

[2]Spinale FG, Coker ML, Krombach SR,et al. Matrix metalloproteinase inhibition during the development of congestive heart failure: effects on left ventricular dimensions and function[J]. Circ Res,1999，85:364-376

[3]Spinale FG, CokerML, HeungLJ,et al. A matrix metalloproteinase induction/activation system exists in the human left ventricular myocardium and is upregulated in heart failure[J]. Circulation，2000,102:1944-1949

[4]Guo Y,He J,Wu J, et al.Locally Overexpressing Hepatocyte Growth Factor Prevents Post-ischemic Heart failure by Inhibition of Apoptosis via Calcineurin-mediated Pathway and Angiogenesis[J]. Arch Med Res,2008,39(2):179-188

[5]Ortiz LA，Dutreil M，Fattman C，et al． Interleukin 1 receptor antagonist mediates the antiinflammatory and antifibrotic effect of mesenchymal stem cells during lung injury[J]． Proc Natl Acad Sci USA，2007，104: 11002-11007

佳木斯大学研究生科技创新项目，编号：YM2016_034。

石慧(1990～)女，黑龙江牡丹江人，在读硕士研究生。

艾迎春(1960～)女，黑龙江佳木斯人，硕士，主任医师，硕士研究生导师。E-mail：haiyan7416_ncmc@163.com。

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1008-0104(2017)04-0063-02

2016-10-10)