山茱萸多糖对局灶性脑缺血-再灌注损伤神经胶质细胞的作用①

邓文伟，杨广禄，邓 萌，王淑英

(1. 佳木斯大学口腔医学院，黑龙江 佳木斯 154002；2. 佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007)

山茱萸多糖对局灶性脑缺血-再灌注损伤神经胶质细胞的作用①

邓文伟1，杨广禄1，邓 萌1，王淑英2

(1. 佳木斯大学口腔医学院，黑龙江 佳木斯 154002；2. 佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007)

目的:研究山茱萸多糖对大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤的作用。方法：大鼠随机分为A组(假手术组)，B组(缺血-再灌注组)，C组(山茱萸多糖干预组)，每组25只。制作大鼠局灶性脑缺血模型，免疫组化法测定GFAP、S-100蛋白、MBP的表达。结果：脑缺血-再灌注，B组星形胶质细胞(AS)GFAP表达增强；小胶质细胞S-100蛋白表达增强；少突胶质细胞MBP表达减少。C组较B组GFAP表达减弱；S-100蛋白表达减少；MBP表达增强。结论：山茱萸多糖可抑制AS反应性增生、可抑制小胶质细胞激活、抑制少突胶质细胞损伤。

山茱萸多糖;局灶性脑缺血-再灌注;神经胶质细胞

国内外学者对山茱萸的各种化学成分、药理作用已有较系统的研究，其制剂广泛用于治疗心脑血管等疾病。许多实验表明神经细胞在脑缺血-再灌注中易受到损伤，且山茱萸多糖对神经细胞具有保护作用[1，2]，但其对神经胶质细胞的作用研究较少。在脑组织中，神经胶质细胞对缺血缺氧较敏感，在缺血-再灌注中也易发生损伤。本实验研究山茱萸多糖对脑缺血-再灌注损伤后大鼠神经胶质细胞的影响，以期在临床治疗过程中为山茱萸多糖的应用提供有一些更有价值的线索。

1 材料与方法

1.1 动物

Wistar成年大鼠， 280～350g，随机被分为对照组(A组)：不栓塞，只分离大脑中动脉；缺血-再灌注组(B组)，大脑中动脉栓塞2h，24h后进行再灌注；山茱萸多糖治疗组(C组)：大脑中动脉栓塞2h，栓塞后2min内注射山茱萸多糖于尾静脉(20mg/kg)，24h再灌注，其间给药3次。每组25只大鼠。手术前大鼠禁食12h，自由饮水。

1.2 模型制备

颈内动脉插线法造模[3～5]。3.5%水合氯醛麻醉大鼠(350mg/kg)。将其仰卧、固定，将颈部正中皮肤切开，分离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，分离过程中注意不要刺激迷走神经。由颈总动脉的分叉处向头端依次分离，将颈外动脉所有分枝烧断，使主干游离。分离颈内动脉至颅底，分离翼腭动脉颅外段。用蛙心夹夹住颈总动脉和颈内动脉， 将手术缝合线放置在颈外动脉根部，在颈外动脉上剪一小口，位置靠近颈总动脉分叉处，沿切口插入蘸有肝素钠溶液栓子入颈外动脉，为防止出血和栓子滑出，缚紧手术缝合线，松开蛙心夹，沿入颅方向缓慢地将栓子推进颈内动脉，长度大约19～21mm，稍有阻力即停。此时，栓子头端停留在大脑中动脉与大脑前动脉分叉处。栓子固定好，即一侧大脑中动脉的栓塞完成。栓塞后2h，进行大脑中动脉再灌注：即将栓子头端轻拉到颈外动脉内，开始再灌注。

1.3 山茱萸多糖治疗

手术后2min内向尾静脉注射山茱萸多糖(20mg/kg)，每日3次。

1.4 神经病学评分

按照神经缺陷三级评分的标准[6]，符合三级评分标准的大鼠才能进行下一步试验。

1.5 神经胶质细胞检测

1.5.1 GFAP蛋白表达检测

(1)用Poly-lysine将载玻片处理;(2)用低温恒冷切片机切20μm厚连续切片，切片捞在经处理过的载玻片上；(3)纯丙酮室温条件下固定30min。蒸馏水冲洗、干燥、冰冻保存；(4)用加H2O2纯甲醇(0.3%)室温30 min浸泡，灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水冲洗3次。(5)于室温滴加正常山羊血清封闭液，20min后多余液体去除；(6)滴加稀释的一抗GFAP(1：100)，4℃过夜。0.1M PBS冲洗，每次2min，共计3次；(7)滴加IgG(山羊抗小鼠)，37℃ 20min。0.1M PB冲洗，每次2min，共计3次；(8)滴加HIGH-SABC，37℃ 20min，0.1M PBS冲洗，每次5min，共计4次；(9)DAB显色;(10)轻度苏木素复染。脱水、透明、封片。镜下观察。

1.5.2 S-100蛋白表达检测

滴加的一抗为S-100，其他方法同上。

1.5.3 MBP蛋白表达检测

滴加的一抗为MBP，其他方法同上。

1.6 统计学方法

2 结果

大鼠GFAP、S-100、MBP的表达，见表1。

表1 大鼠GFAP、S-100、MBP阳性表达 细胞数(个/400×视野，

给药组与假手术组相比P﹤0.05；与模型组相比P﹤0.05。

3 讨论

实验结果显示AS在脑缺血-再灌注损伤发生的反应表现为AS反应性增生，GFAP含量增高。当CNS损伤时，通过AS上的相应受体神经细胞释放的细胞因子可刺激其分裂、增生，AS在其中某些因子的刺激下能产生和释放细胞因子。这些因子反过来又提高它们的增殖[7]。AS对损伤发生的早期反应为AS自分泌的GFAP，是促进AS增生的主要细胞因子。在损伤区附近GFAP免疫活性明显增加。山茱萸多糖干预组AS损伤较缺血-再灌注组明显减轻(P﹤0.05)，其可能机制是山茱萸多糖能够抑制GFAP蛋白的表达，减轻AS的增生。实验中山茱萸多糖干预组小胶质细胞增生减轻，S-100蛋白表达减少。小胶质细胞具有钾离子内外流动方式[9]，对胞外钾离子浓度的变化非常敏感，因此，脑缺血后小胶质细胞兴奋过度、细胞内外钾离子浓度的变化可能是小胶质细胞活化的主要原因，山茱萸多糖可能是通过控制钾离子的浓度从而起到保护作用。研究结果显示脑缺血-再灌注损伤后少突胶质细胞MBP表达减少。这可能是少突胶质细胞比其他胶质细胞对缺血缺氧性损伤更为敏感的原因所致。少突胶质细胞胞体与星形胶质细胞和神经细胞相比，含铁和铁结合蛋白较丰富，谷胱甘肽含量较低，在自由基连锁反应过程中铁是催化剂，在细胞内还原型谷胱甘肽能清除自由基，是天然的清道夫。再灌注应激反应后细胞代谢过程明显依赖氧化磷酸化，缺血缺氧的少突胶质细胞在这种代谢中最易发生应激性损伤[9]。山茱萸多糖干预组少突胶质细胞MBP阳性表达较正常组少，比缺血-再灌注组多。原因可能是山茱萸多糖能清除自由基，这样由膜脂质过氧化引起的细胞外Ca2+内流就可受到抑制，由Ca2+浓度升高造成的各种损害就会减少，从而使少突胶质细胞的损害减轻，对少突胶质细胞起到保护作用。

[1]范慧晗,刘泰佐,毛金军,等. 山茱萸多糖对AD大鼠c-fos和早老素-1表达的影响[J].中国老年学杂志,2015,35(13):3513-3516

[2]姚海涛，马金丽，张晓波,等.山茱萸多糖对阿尔茨海默病模型大鼠tau蛋白的影响[J].中国老年学杂志, 2013,33(12):2838-2841

[3]Nagasawa H,Kogure K. Correlation between cerebral blood flow and histologic changes in a new rat model of middle cerebral artery occlusion [J]. Stroke, 1989,20:1037-1043

[4]汪家龙,刘才栋.实验性急性脑缺血模型及其研究进展[J].解剖科学进展，1999， l5(3):212-214

[5]马常升,马文领.插线法制备大鼠局灶性脑缺血-再灌注模型的研究[J].解剖学杂志，1999,22(3): 209-213

[6]Kuluz JW,Prado RJ,Dietrich D,et al.The effect of nitric oxide synthase inhibition on infarct volume after reversible focal ischemia in conscious rats[J].Stroke,1993,24:2023

[7]郑观成主编.脑老化与老年痴呆.老年痴呆与系统工程[M].上海:上海科学技术文献出版社,1995

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[9]Juurlink BH. Response of glial cells to ischemia: roles of reactive oxygen species and glutathione[J]. Neurosci Biobehav Rev, 1997,21(2):151-166

1.黑龙江省卫生厅科研项目，编号：2014-256；2.黑龙江省中医药管理局项目，编号：ZHY16-018。

邓文伟(1963～)男，黑龙江佳木斯人，学士，教授，硕士研究生导师。

王淑英(1974～)女，黑龙江佳木斯人，博士，副教授。E-mail:lycwsy3742@163.com。

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