食品中菌落总数测定不确定度评定的应用

朱勇

荣昌区疾病预防控制中心，重庆 402460

食品中菌落总数测定不确定度评定的应用

朱勇

荣昌区疾病预防控制中心，重庆 402460

目的 分析食品中菌落总数检测结果的不确定度的来源，减少实验误差，提高检测结果的准确性。方法 依据JJF1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》、GB/T4789.2-2010食品微生物学检验《菌落总数测定》和《2015国家食品污染和有害因素风险监测工作手册》（菌落总数标准操作程序）分析影响菌落总数检测结果的几个因素从而探讨不确定度的评定方法。结果建立了简便的食品中菌落总数测定不确定度评定方法。结论 影响菌落总数检测结果的不确定度的因素有9种，稀释样品溶液引入的相对标准不确定度、加样体积的相对标准不确定度、平板上菌落数的相对标准不确定度3个不确定分量是评定菌落总数检测结果不确定度是必须计算的分量，不同实验室可根据自身情况对菌落总数检测结果不确定度进行评定时引入其他6种因素引起的不确定度。

食品；菌落总数；不确定度

菌落总数是微生物检验中常见的指标，反映食品在生产过程中是否符合卫生要求。测量不确定度是表征合理地赋予被测量的分散性，是目前国际公认的用来评价检测结果质量的参数。一切结果都具有不确定度，因此菌落总数的检测结果也具有不确定度。近年来，理化检测结果不确定度的评定较为统一规范，而微生物检测结果不确定度的评定尚无成熟规范的方法，不少文献提出，对同一样品重复测量多次，计算菌落总数测量结果的算术平均值及标准差，从而计算测量结果的不确定度，这是不符合实际工作的。该文以荣昌区2015年一组食品风险监测项目熟肉制品的菌落总数为例，依据JJF1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》[1]GB/T4789.2-2010《菌落总数测定》[2]和《2015国家食品污染和有害因素风险监测工作手册》（菌落总数标准操作程序）[3]建立食品中菌落总数检测结果的不确定度的评定方法，并探讨其各种不确定度分量。

1 资料与方法

1.1 材料

重庆市荣昌区2015年食品风险监测项目熟肉制品菌落总数检测结果数据一组。

1.2 仪器设备与试剂

TP-202型天平；Therm-IGS180型电热恒温生化培养箱；SW-CJ型超净工作台；LMQ.C型高温蒸汽灭菌锅；YH-4001型拍击式均质器。平板计数琼脂（批号:150211）。

1.3 检测过程

依据中华人民共和国国家标准GB/T4789.2-2010《菌落总数测定》和《2015国家食品污染和有害因素风险监测工作手册》（菌落总数标准操作程序）用平板培养和菌落计数的方法。以无菌操作称取检样25 g放入均质袋内，加入225 mL灭菌生理盐水，用拍击式均质器拍打2 min，制成1:10的均匀稀释液备用，根据对样品污染度的估计，选择了3个连续稀释度（拟为等于或者大于1的整数），接种平板计数琼脂，每个稀释度接种两个平皿各1 mL同时取生理盐水做1份空白对照，将冷却至46℃的平板计数琼脂倾注到平皿内，轻轻转动混匀，待琼脂凝固后，翻转平皿，置37℃培养48 h，计数各菌落总数，测量菌落总数时，选定平板上菌落数为30～300 CFU或者接近30～300 CFU的稀释度来计算和报告检测结果，最后取选定稀释度的两个平板上的菌落数平均值乘以稀释倍数10n作为该试样的单位（体积）菌落数。

2 建立数学模型

2.1 菌落总数测量的计算

假设Y为样品单位体积的菌落总数；F为样品稀释倍数(10的若干指数倍)；N为培养基平板的菌落计算结果；V为平行检测平板中所加样品的稀释液的体积（即样品经10倍系列稀释所得的样品和生理盐水的混合液），则该试样单位（体积）的菌落数Y可由下式算出：

2.2 不确定度的主要来源与确认

通过该理论公式①，若以相对标准不确定度来表示各种不确定度，则菌落数Y的相对不确定度Urel(Y)可由下式算出：

式②中：Urel(F)—稀释样品溶液引入的相对标准不确定度；Urel(V)—加样体积引入的相对标准不确定度;Urel(N)—平板上菌落数引入的相对标准不确定度。

3 试样中菌落总数测量的相对标准不确定度分量的计算

由理论公式②可知菌落总数测量的的数学评估模型中3个不确定度分量相互独立，为方便不确定度运算，下面均以相对标准不确定度来表示各相应的不确定度。

3.1 取样稀释样品溶液引入的相对标准不确定度Urel(F)

不确定度分量有3个:①称重时天平引入的相对标准不确定度Urel(M)；②实验室温度效应引入的相对不确定度Urel(T)；③量筒及玻璃吸管自身校准引入的相对标准不确定度Urel(C)。相对不确定度分量Urel(M)、Urel(T)和Urel(C)分析如下。

3.1.1 试样在称重时天平引入的相对标准不确定度urel(M)试样称量，使用天平称取样品时，根据JJG98-2006《非自动天平鉴定规程》[4]规定，0.01 g精密度天平称量最大允守候差为±0.01 g，该实验中均取样25.00 g，天平线性MPE为矩形分布，该不确定度需计算两次，一次为皮重，一次为总重。通过计算得到由天平最大允许误差引入的相对标准不确定度：

3.1.2 稀释样品溶液引入的相对标准不确定度Urel(C)本试验中使用250 mL的量筒，10 mL和1 mL的玻璃吸管，计数的平皿稀释度为10-n检测时温度为15℃，因此不确定度主要由250 mL的量筒和10 mL、1 mL的玻璃吸管的容量允差和温度偏离引起的溶液和容器涨缩引起。根据JJG196-2006《常规玻璃器鉴定规程》[5]，250 mL的量入式量筒最大允许误差为±1.0 mL，10 mL玻璃吸管最大允许误差为±0.1 mL，1 mL玻璃吸管最大允许误差为±0.015 mL,允差为矩形分布，由此产生相对标准不确定度为：

实验室温度效应引入的相对不确定度Urel(T)

由10 mL的玻璃吸管引入的不确定度：

由1 mL的玻璃吸管引入的不确定度：

按照计数的平皿稀释度10n的不同,上述不确定度分量合成Urel(F)不同，得下式:

3.2 加样体积引入的相对标准不确定度urel(V)

由于每个计数平板所加的样品稀释液体积均为1 mL玻璃吸管,与上述稀释过程中1 mL的玻璃吸管相同，因此加样体积的相对标准不确定度Urel(V)=urel(C3)，根据稀释倍数10n不同，即可算出Urel(V)2=0.931%×n。

3.3 平板上菌落数引入的相对标准不确定度Urel(N)

培养基计数平板上所查计的菌落总数均值是2个1mL所加试样(稀释匀液)中细菌经过分别培养出来的菌落总数均值。在一系列充分混匀的等量的粒子悬液(1 mL试样稀释均匀液)中粒子(细菌)数的随机性服从泊松分布(Poisson scatter)，所以菌落总数(均值)在培养基平板上的随机误差的不确定度可用泊松分布来表示，根据《GB/T4789.2-2010菌落总数测定》菌落总数的计算方法的不同，该相对标准不确定度计数方法也不同，分为下面两种情况：

当只选定一个稀释度的平行检测的两个计数平板上的菌落数的检测结果为Nm、Nm+1时，菌落总数的均值

则泊松分布引起的相对标准不确定度

当有两个连续稀释度的平板菌落数在30～300 CFU之间时，假设实验室试样单位体积的培养基平板菌落第一稀释度（低稀释度）两个平行测定计算结果为Nm、Nm+1，第二稀释度（高稀释度）两个平行测定计算结果为Nm+2、Nm+3，计算连续稀释度所产生的相对标准不确定度Urel(N)以第一稀释度（低稀释度）计算结果为准，那么相当于第一稀释度的菌落总数的均值，

表1 重庆市荣昌区2015年食品风险监测项目熟肉制品菌落总数检测结果不确定度评定分析

则泊松分布引起的相对标准不确定度

3.4 菌落数检测结果合成相对标准不确定度Urel(Y)和合成标准不确定度UY

因此，按照操作人员对样品污染状况的估计，选择适宜n个适宜稀释度样品匀液进行10倍递增稀释中n值得不同和菌落总数的计算方法的不同，试样中菌落总数测量的相对标准不确定度分量合成情况也不同

3.5 菌落数检测结果扩展标准不确定度U

当p=95%时，包含因子k=2，则扩展不确定度U=2×UY。

4 不确定度的报告

报告菌落总数检测结果时，应同时附上扩展标准不确定度U和包含因子K。例样品1菌落总数均值N为237 CFU,菌落计数稀释度为102,扩展标准不确定度U为80，则菌落总数检测结果报告为（2.4±0.8）×104CFU,包含因子K=2。

5 评定不确定度过程的讨论

5.1 当样品为液体时不确定度的评定

当样品为液体时，按照GB/T4789.2-2010《菌落总数测定》则用吸管吸取检样25 mL，因此在计算不确定度时，应将称重时天平引入的相对标准不确定度Urel(M)应转换成25 mL的玻璃吸管引入的相对标准不确定度。

5.2 其他不确定度分量

上述的取样稀释样品溶液引入的相对标准不确定度Urel(F)、加样体积的相对标准不确定度Urel(V)和平板上菌落数的相对标准不确定度Urel(N)是根据建立的数学模型理论公式①得来，在实际测量过程中，影响菌落总数的检测结果不确定度除了上述3个因素之外，还包括以下几种因素引起的不确定度：①检测人员计数产生的相对标准不确定度Urel(P)；②计数平板上菌落的重叠引入的相对标准不确定度Urel(O)；③培养基的菌落生长率引入的相对标准不确定度Urel(S)；④试样的不稳定引入的相对标准不确定度Urel(E)；⑤数字修约引入的不确定度Urel(R)；⑥培养条件产生的相对标准不确定度Urel(H)。则菌落数Y的完全相对不确定度Urel(Y)计算完全公式应该为：Urel(Y)2=Urel(F)2+Urel(N)2+Urel(V)2+Urel(P)2+Urel(O)2+Urel(S)2+Urel(E)2+Urel(R)2+Urel(H)2。各实验室可以根据自身情况对菌落总数检测结果不确定度评定的时候引入以下几种因素引起的不确定度使不确定度评定更加准确。

5.2.1 检测人员计数产生的相对标准不确定度Urel(P)检测人员在计数培养基平板上的菌落时，因经验和计数平板上菌落的复杂培养结果等而出现随机误差和识别误差，该误差通过对同一个培养基平板的菌落进行多次重复计数后统计得出，可以采用贝塞尔公示进行计算出相对标准不确定度。该文暂忽略了该不确定度。

5.2.2 计数平板上菌落的重叠引入的相对标准不确定度Urel(O)计数平板上菌落的重叠不确定度随菌落在平板上的覆盖面积不同而异。如平板上的菌落覆盖面积为5%、10%、15%、20%、时，对应相对标准不确定度Urel(O)则分别为 0.02、0.04、0.06、0.08[6]。 其值不易判定，所以该文忽略了该不确定度

5.2.3 培养基的菌落生长率引入的相对标准不确定度Urel(S) 该实验培养基为非选择培养基，实验室配制或商品化的成品培养基的质量依赖于其制备过程，采用不适宜方法制备的培养基将影响微生物的生长或复苏，从而影响菌落生长率，产生不确定度。因此所有配制好的培养基均应进行质量控制试验，通过与确认合格培养基进行比对，从而计算出不确定度。该文也暂时忽略了该不确定度

5.2.4 试样的不稳定引入的相对标准不确定度Urel(E)样品在受理之后测量之前，受试样特性、细菌本身特性和样品存储运输条件的的影响，细菌会发生数量变化，即引入不确定度。通常情况下，此类相对标准不确定度不易计算，可以通过对试样进行保鲜存储运输，减少储存时间等方式来消除该不确定度。该文暂时忽略了该不确定度

5.2.5 数字修约引入的标准不确定度Urel(R) 按照国家标准GB/T4789.2-2010《菌落总数测定》检测结果采用两位有效数字当菌落数大于或等于100 CFU时，用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约，如Y.X×10nCFU（Y≥1，X≥0，n≥2），其修约间隔为 0.1×10nCFU；菌落数小于100 CFU时，其修约间隔为1 CFU。其修约间隔引起的不确定度为均匀分布[6]，由此产生的标准不确定度分别为由于数值均很小，该文忽略了该不确定度。

5.2.6 培养条件产生的相对标准不确定度Urel(H) 培养条件中，温湿度等环境因素也会影响菌落的生长，因此可以通过控制环境因素来消除该不确定度，由于该不确定度不易计算，该文暂时忽略了该不确定度。

5.2.7 正确建立数学模型是评定菌落总数检测结果不确定的基础 菌落总数测量结果是由文中理论公式①换算而来，相应的菌落测量结果的不确定度与样品稀释倍数、培养基平板的菌落计算结果、平行检测平板中所加样品的稀释液的体积3个变量不确定度有关，故汤水平等[6]、刘丽花等[7]、陈建琳等[8]、范媛媛等[9]在评定菌落总数检测结果不确定度时建立数学模型为y=x是不合理的，没有考虑样品稀释倍数和平行检测平板中所加样品的稀释液的体积对检测结果的影响，因此不确定度也不能正确的评定。

5.2.8 关于多次测量同一样品而评定不确定度 汤水平等[8]、刘丽花等[9]、陈建琳等[10]、范媛媛等[11]、汪艳玲等[12]提出对同一样品重复测量10次或者20次，然后计算菌落总数测量结果的算术平均值及标准差或者对数平均值及其标准差来计算测量结果的不确定度。在实际检测工作中微生物检测样品通常不稳定，存在动态污染变化等问题，这种多次重复检测浪费检测时间，因此对同一样品进行多次检测的不确定度评定方法是不符合工作实际的。

5.2.9 关于合并不同样本的标准差而评定样品的不确定度 刘丽花等[9]、陈建琳等[10]、范媛媛等[11]提出，把一组不同时间，不同人员测量的样品菌落总数结果用贝塞尔公式计算出检测结果对数值标准差的合并样本标准差，进而把该标准偏差当作其中任一样品菌落数测量结果的标准不确定度;随着检验结果的不断增加，可随时将新样品的测定测量与以往样品的测量结果混到一起重新计算合并样本标准差，更新测量结果的标准不确定度取值范围。从统计学上讲，合并样本标准差的计算必须是所有被合并计算的样本测量结果都是在规定条件(测量重复性条件或测量复现性条件或期间测量精密度条件)下对同一或类似被测对象的重复测量的结果，同时样品测量的目标含量应该稳定和接近。然而不同时间，不同人员在测量不同样品时，样品的菌落总数结果不同，检测时的温度，仪器的精密也可能不同，其菌落数检测结果的不确定度也就不可能相同，另外如果把每次新样品的测量结果与以往样品的测量结果合并计算标准偏差时，就会产生一个新的合并样品标准差作为新样本测量结果的标准不确定度，这样做法显然是错误的，因为一个样品检测结果不确定度应该是确定的。

[1]JJF1059.1-2012，测量不确定度评定与表示[S].北京：北京质检出版社，2010.

[2]GB/T4789.2-2010，食品微生物学检验菌落总数测定[S].北京：北京标准出版社，2010.

[3]2015国家食品污染和有害因素风险监测工作手册（菌落总数标准操作程序）[S].北京：北京质检出版社，2010.

[4]胡巅，丁李素芳.食品的菌落数检测结果不确定度之评定[J].中国卫生检验杂志，2008，8（18）:1494-1497.

[5]JJG98-2006，非自动天平鉴定规程[S].

[6]JJG196-2006，常规玻璃器鉴定规程[S].

[7]周红雨.泊松分布应用于菌落总数测得质量控制[J].中国卫生检验杂志，2000，6（10）:3317-3318.

[8]汤水平,王力清,李静芳,等.婴幼儿配方奶粉菌落总数检验中不确定度的评定[J].微生物学杂志，2009，5（29）:100-103.

[9]刘丽花，周红，任永红.菌落总数测定中的不确定度评定[J].中国卫生检验杂志，2007，17（34）:3317-3318.

[10]陈建琳，顾永洋，徐会.水中菌落总数测定不确定度评定的应用[J].中国卫生检验杂志，2016，20（26）:2931-2930.

[11]范媛媛，王树祥，朱宇旌.食品菌落总数检验中不确定度的评定[J].中国卫生检验杂志，2007，2（17）:296-297.

[12]汪艳玲，赵怀荣，刘纯成.农村生活饮用水菌落总数不确定度评定[J].中国卫生检验杂志，2016，21（26）:3123-3125.

R446.5

A

1672-5654（2017）06（c）-0041-04

2017-03-21）

10.16659/j.cnki.1672-5654.2017.18.041

朱勇（1982-），男，重庆人，本科，主管技师，主要从事微生物检验工作。