抗菌肽体外抑制猪源大肠杆菌的效果

宋子杰 孙鑫鹏 韩 梦 张纯瑶 韩先杰

试验研究

抗菌肽体外抑制猪源大肠杆菌的效果

宋子杰 孙鑫鹏 韩 梦 张纯瑶 韩先杰*

（青岛农业大学动物科技学院 山东 青岛 266109）

为了检测某公司开发的抗菌肽在体外对猪源大肠杆菌的抑制效果，本试验利用琼脂扩散法和肉汤稀释法来测定该抗菌肽在体外对从猪场分离到大肠杆菌的抑制作用。琼脂扩散法结果显示4株细菌的抑菌圈直径都大于10mm；肉汤稀释法测得3株菌的MIC值为250μg/ml，1株菌的MIC值为2000μg/ml。结果表明，该抗菌肽在体外能够抑制大肠杆菌的生长，具备一定的抗菌效果。

猪 大肠杆菌 抗菌肽 抑制

猪大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的传染性较强的猪的肠道传染病。在现代规模化养殖中，对猪大肠杆菌病的的治疗多为抗生素类药物。由于大肠杆菌的血清型众多并且比较复杂，加之大肠杆菌在革兰阴性菌中是最易产生耐药性的细菌，所以大量的使用抗菌药物会导致大肠杆菌产生普遍的耐药性[1-4]。根据各地有关部门的统计，我国大部分地区猪源大肠杆菌对抗菌药物已经出现了不同程度的耐药性。多重耐药率主要表现在对6～10种抗菌药有耐药性，几乎没有耐药率为0%的地区。与国外报道相比，我国猪源大肠杆菌的耐药率更高、耐药谱更加复杂[5]。因此寻找一种新的抗菌物质代替抗生素治疗大肠杆菌病是非常重要的。天然生物抗菌肽的抗菌谱非常广，具有抗病毒、真菌、细菌、抑杀癌细胞等多种生物活性，特别是对多重耐药菌具有明显的杀伤作用，且不易产生抗药性。抗菌肽对机体的正常细胞没有任何副作用，并且化学性质稳定，不易被病原体分解[6-8]。本文利用琼脂扩散法和肉汤稀释法来测定某种抗菌肽在体外对2016年从胶东地区猪场分离到的4株大肠杆菌的抑制作用，从而为抗菌肽的使用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 病料来源 病料为2016年3～5月份胶东地区某些猪场发生腹泻的病猪的粪便。

1.1.2 主要试剂 抗菌肽为某公司开发；革兰氏染色液试剂盒购自北京陆桥技术有限责任公司； MH肉汤、MH培养基、麦康凯琼脂等购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；细菌微量发酵管购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.2方法

1.2.1 细菌分离 无菌环境下将所采粪便划线接种与麦康凯培养基上，37℃培养24h，观察细菌生长特性。挑取单个菌落进行革兰氏染色、镜检，观察细菌的形态。

1.2.2 生化试验 分别挑取单个分离菌接种于细菌微量发酵管中，37℃培养18～24h，观察、记录生化反应结果。

1.2.3 供试品溶液的配制 称1.5g抗菌肽粉末配成100mg/ml的溶液，超声水浴40℃(超声频率为28KHZ)15min使溶解，冷却后离心取上清。用0.45μm(水系)微孔滤膜过滤。

1.2.3 琼脂扩散法抑菌效果评价 将灭菌后的MH培养基置室温使其冷却至50°C左右，每100ml加入1%菌液(OD= 2.30100μl并摇匀。将含测试菌的MH培养基倒入平皿内使均匀摊布，待其在水平台面上凝固后，盖好陶瓦盖，备用。将含菌的MH培养基用灭菌的2.7mm打孔器打孔，每孔中分别加入7µl抗菌肽上清液。37°C培养16～20h。

1.2.4 肉汤稀释法抑菌效果评价 过滤后的样品试液进行倍比稀释，稀释成4000μg/ml、2000μg/ml、1000μg /ml、500μg/ml、250μg/ml，共作4组。将受试菌液用生理盐水调节至在600nm波长检测吸收为0.090～0.10。取适量菌液用MH肉汤稀释100倍。将稀释好的菌液分别等体积的加入供试品液中，封口后于37℃培养。

2 结果

2.1细菌分离与形态观察

37℃培养24h后，细菌在麦康凯培养基上形成圆形、红色、有光泽、边缘整齐的小型菌落。经革兰氏染色，在油镜下观察为红色短杆菌。

2.2生化试验

四株细菌都能发酵葡萄糖、乳糖等糖类，不产硫化氢，MR为阳性，VP为阴性。分离菌的生化反应结果(见表1)与大肠杆菌的生化反应结果大致相符[9]。

2.3琼脂扩散法抑菌效果评价

2.3.1 琼脂扩散 经琼脂扩散试验结果(见表2)，显示抗菌肽对4株细菌都有抑制作用，试验结果如图1～4。

表1 细菌的生化试验结果

表2 琼脂扩散法结果 （mm）

图1 1号菌抑菌效果

图2 2号菌抑菌效果

图3 3号菌抑菌效果

图4 4号菌抑菌效果

2.3.2 肉汤稀释法抑菌效果评价 经肉汤稀释法结果(见表3)，3株菌的MIC值为250μg/ml，1株菌的MIC值为2000μg/ml，说明抗菌肽对这4株细菌有抑制作用。试验结果见图5～8。

表3 肉汤稀释法结果 （μg/ml）

图5 1号菌的MIC值

图6 2号菌的MIC值

图7 3号菌的MIC值

图8 4号菌的MIC值

3 讨论

（1）目前猪大肠杆菌病依然对养殖业造成很大的危害，而过度依赖传统抗生素类药物治疗猪大肠杆菌病导致的耐药性为养殖业造成了更大的潜在危害。所以如何解决耐药菌危机，找出抗生素类药物的替代品，已经成为目前养殖行业面临的重大难题。根据国内外报道[11]显示，市面上现虽有多种抗生素类替代物，但没有一个统一的行业标准，且质量导良莠不齐，加之有些产品价格昂贵，所以在规模化养殖场内并没有被广泛应用。通过对该实验结果进行分析得出，抗菌肽对大肠杆菌有一定抑制作用。（2）抗菌肽的抑菌机理通常被认为是当抗菌肽进入机体后，通过破坏细胞膜的完整性，使细胞内容物流出导致细菌不能保持正常的渗透压，同时增强了吞噬细胞的功能，可以抑制组织纤维蛋白的降解，从而使细菌死亡，具体杀菌过程是：抗菌肽分子两亲性α-螺旋上的正电荷通过静电作用与细菌质膜磷脂分子上的负电荷靠近，接着两亲性α-螺旋进入质膜中，破坏了细菌脂质双分子层的结构，从而在膜上形成离子通道[10]。所以针对实验中出现的前3株菌对该抗菌肽比第4株菌更敏感的问题，分析其原因有可能为前3株菌与第4株菌细胞结构不同，更容易被抗菌肽破坏，第4株菌对该抗菌肽的耐药性较强。（3）目前国内也有报道显示，抗菌肽可以增强动物先天免疫功能[12]，通过动物实验显示，注射抗菌肽的小鼠比同批次没有注射抗菌肽的小鼠的各个免疫器官发育更快，且各项免疫指标更完善。所以建议相关生物公司可以开发此类产品，且养殖公司也可以增加抗菌肽类药物的使用，从而避免耐药菌株的产生，增大养殖效益。

[1] 杨贵树，高红钢. 仔猪大肠杆菌病流行病学调查[J]. 动物科学与动物医学, 2005, 29(12): 28-29.

[2] 李卫东. 规模化猪场仔猪大肠杆菌病的流行新特点和防制对策[J].中国猪业, 2007, 9(6): 34-37.

[3] 吴树康. 规模化猪场大肠杆菌病生物防治技术研究[D]. 泰安: 山东农业大学, 2005.

[4] 宁宜宝, 郑杰, 张纯萍. 我国南方猪高热病的研究—大肠杆菌的分离鉴定和致病性定[J]. 中国兽药杂志, 2006, 40(12): 1-4.

[5] 张星星, 孟庆玲, 乔军等. 我国猪源大肠杆菌的耐药现状及对策[A]. 中国畜牧兽医学会. 中国猪业科技大会暨中国畜牧兽医学会2015年学术年会论文集[C]. 中国畜牧兽医学会: 2015: 1.

[6] 梁英. 抗菌肽的来源及应用[J]. 动物营养学报, 2014, 26(1): 7-16. [7] 李冠楠, 夏雪娟, 隆耀航等. 抗菌肽的研究进展及其应用[J]. 动物营养学报, 2014, 26(1): 17-25.

[8] 李晓颖, 李凤娟, 谷巍等. 一种抗菌肽的体外抑菌试验、安全性评价及其对肠道菌群的影响[J]. 广东饲料, 2014, 23(2): 25-28.

[9] 李一经. 兽医微生物学[M]. 北京: 高等教育出版社, 2011.

[10] 黎观红, 洪智敏, 贾永杰等. 抗菌肽的抗菌作用及其机制[J]. 动物营养学报, 2011, 23(4): 546-555.

[11] 丹尼·扈奇. 抗生素替代物的现状和远景[J]. 饲料广角, 2006, 5 (11): 31-34.

[12] 国果, 吴建伟, 付萍等. 家蝇幼虫分泌型抗菌肽对小鼠免疫功能影响[J]. 中国公共卫生, 2012, 28(5): 619-620.

S859.79+6

A

1007-1733(2017)08-0001-03

2017–03–11）

山东省现代农业产业技术体系生猪创新团队养猪生产与环境控制岗位（SDAIT-08-10）

*通讯作者