碱性蛋白酶抑制剂lupI-MSSS原核表达载体的构建及其蛋白表达、纯化

王昆，梁朋娟，李尚勇，王伟，孙晶晶，刘均忠，孙谧，郝建华*

1(农业部极地渔业开发重点实验室,海洋国家实验室海洋药物与生物制品功能实验室，中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东 青岛，266071)2(上海海洋大学食品学院，上海，201306)

碱性蛋白酶抑制剂lupI-MSSS原核表达载体的构建及其蛋白表达、纯化

王昆1,2，梁朋娟1，李尚勇1，王伟1，孙晶晶1，刘均忠1，孙谧1，郝建华1*

1(农业部极地渔业开发重点实验室,海洋国家实验室海洋药物与生物制品功能实验室，中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东 青岛，266071)2(上海海洋大学食品学院，上海，201306)

低温碱性金属蛋白酶MP是从菌株YS-80-122中提取纯化的，属于沙雷氏蛋白酶家族，与该家族报道的其他酶的结构类似，在MP基因下游有一抑制剂基因lupI，该抑制剂可以完全抑制蛋白酶MP的活性。在野生型抑制剂基因的基础上，通过定点突变将LupI的N端增加Met-Ser-Ser-Ser，命名为LupI-MSSS，通过构建pET28a-lupI-MSSS原核表达载体，转化大肠杆菌BL21 (DE3)并诱导表达，SDS-PAGE凝胶电泳结果表明该蛋白的大小约11 kDa, 与预测的蛋白分子量一致。对影响蛋白诱导表达的诱导剂添加时间、诱导温度、异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG) 浓度、诱导时间4个因素进行优化，并经初步优化得到了其诱导表达的条件为：接种量2%，诱导剂添加时间3 h，诱导剂IPTG终浓度0.5 mmol/L，诱导温度为37 ℃，诱导时间为8 h。表达的蛋白依次通过超滤，Superdex 200凝胶过滤层析，Q-Sepharose离子交换层析进行纯化，结果显示目的蛋白纯化倍数为20，比活力为15 720 U/mg，活性回收率达60.7%，纯化后的lupI通过高效液相色谱法进行纯度分析，其纯度可达99%以上。

蛋白酶抑制剂；原核表达；蛋白纯化

蛋白酶是催化肽键水解的常用研究和工业用酶，是继淀粉酶之后一种新的在全世界广泛应用的酶制剂(主要应用在食品、制革、日化和医药行业等)[1-2]。沙雷氏蛋白酶是一种广泛存在于革兰氏阴性菌中的胞外分泌蛋白，特别是沙雷氏菌属、欧文氏菌属和假单胞杆菌属中[3]。在研究不同种类沙雷氏蛋白酶的过程中发现：这类蛋白酶基因附近都有一段抑制其酶活性的抑制剂基因[4]该抑制剂的基因与蛋白酶基因在基因组序列中处于紧邻的位置，属于同一个分泌体。该抑制剂蛋白分子量一般在11.5 kDa左右，存在于周质空间，在蛋白酶分泌过程中保护有机体不被体外分解[5]。

海洋细菌YS-80是本研究团队从黄海水样中分离到的1株高产低温碱性蛋白酶的菌株。对YS-80所产的主要的碱性蛋白酶进行了分离纯化，将其命名为MP，并对其进行了详细的性质研究，在此基础上对编码MP的基因进行了克隆[6]。该蛋白酶MP属于沙雷氏蛋白酶家族，通过蛋白序列和晶体结构比较获得该蛋白酶MP与沙雷氏蛋白酶家族的氨基酸同源性最高达83%。并通过悬滴法获得了该蛋白酶的晶体结构[7]。另外，实验室在前期扩增MP基因lupA的过程中也获得了1个抑制剂基因序列lupI,该基因位于蛋白酶MP基因下游，lupI与现有沙雷氏蛋白酶抑制剂APRin的同源性仅为40.9%。抑制剂lupI可完全抑制蛋白酶MP的活性，但是其在胞内的确切生物功能还不清楚[6,8]。

大肠杆菌表达系统是目前最常用的外源蛋白表达系统[9],具有遗传背景清楚、代谢调控技术成熟、目的基因表达水平高、培养成本低、生长周期短等特点,在重组蛋白质外源基因表达系统中占据主导地位[10]。为进一步探究N端序列延伸后对抑制剂活性的影响，在野生型抑制剂基因的基础上，通过定点突变将LupI的N端增加Met-Ser-Ser-Ser，本文主要通过构建pET28a-lupI-MSSS原核表达载体在大肠杆菌中表达，通过单因素试验对该抑制剂的发酵表达条件进行优化，确定较优的诱导表达条件。并对蛋白进行纯化，以满足后续试验研究的要求。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

菌株FlavobacteriumSP. YS-80-122由本研究团队自黄海水域获得并鉴定保存；细菌基因组DNA提取试剂盒,Omega；大肠杆菌BL21感受态细胞,康为世纪有限公司；pET28a表达载体菌株，康为世纪有限公司；快速质粒小提试剂盒，康为世纪有限公司；卡那霉素(kanamycin, Kana)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG)，Sigma公司；蛋白胨(Tryptone)和酵母粉(Yeast Extract)，英国Oxoid公司；Color Prestained Protein Marker，北京康润诚业生物科技有限公司；其他试剂,分析纯，国药集团。

定性梯度PCR仪，德国Biometra公司；SHIMADZU UV-2550岛津分光光度计，日本岛津公司；SW-CJ型超净工作台，中外合资苏州安泰空气技术有限公司；20PR-52D高速冷冻离心机，日立公司；LKB2219恒温水浴，瑞典BROMMA公司；JY96-ⅡN型超声波细胞粉碎机，宁波新芝科技生物股份有限公司；超滤杯，美国默克公司；Bio-Rad Mini III蛋白电泳仪，美国伯乐公司；高效液相色谱仪，美国waters公司；快速液相色谱仪，美国通用电气。

1.2方法

1.2.1 溶液配制

100 mg/mL Kana贮存液配制：1 g Kana溶于10 mL双蒸水中，0.22 μm 的滤膜过滤除菌，分装后于-20 ℃保存。

1 mol/L IPTG贮存液配制：2.38 g IPTG溶于10 mL双蒸水中，0.22 μm的滤膜过滤除菌，分装后于-20 ℃保存。

LB液体培养基：蛋白胨 1%，酵母抽提物0.5%，NaCl 1%。LB固体培养基，LB液体培养基+琼脂2%。

1.2.2 抑制剂蛋白浓度的测定

采用Bradford法[11]，以牛血清白蛋白为标准蛋白。

1.2.3 lup-MSSS抑制活性测定

粗酶液的制备：蛋白酶MP酶粉0.5 g溶解在10 mL水中，10 000 r/min离心30 min，上清稀释200倍为待测酶液。

抑制剂溶液制备：表达后的抑制剂按菌液体积的1/10加入50 mmol/L的Tris-HCl(pH8.0),200 W超声破碎，10 000 r/min离心15 min后留上清。稀释5倍，为抑制剂溶液。

活性测定参考国家标准GB/T 23527—2009，具体如下：1 mL酶液与10 μL抑制剂混匀30 ℃静置10 min；实验对照为1 mL酶液加10 μL水混匀。加入1 mL含1%的酪素溶液，30 ℃水浴10 min，2 mL 0.4 mol/L三氯乙酸(TCA)终止反应，静置过滤；空白对照加样顺序为：酶液-TCA-酪素。取滤后溶液1 mL加0.4 mol/L NaCO3溶液5 mL、福林试剂1 mL，混匀，置于40 ℃水浴中显色20 min取出，冷却至室温，680 nm波长下比色。以稀释后的粗酶液1mL作为标准，以每毫升酶液在30 ℃、pH 7.0条件下水解酪蛋白，每分钟释放1 μg酪氨酸所含的酶量定义为1个酶活单位。抑制剂抑制活性用实验对照组酶活与加抑制剂组酶活差值表示。

1.2.4 PCR扩增基因片段

利用定点突变试剂盒设计合成两端引物，以LupI野生型表达质粒pET28-lupI为模板，进行PCR反应，获得编码抑制剂LupI-MSSS的目的基因片段。PCR扩增条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，55℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循环32次，最后72 ℃再延伸10 min。用1.0% 琼脂糖凝胶电泳观察PCR产物。

1.2.5 pET28a-lupI-MSSS原核表达载体的构建及鉴定

将上述PCR扩增得到的基因片段和pET28a原核表达载体分别用NcoI和SalI两种限制性内切酶双酶切，然后进行电泳分离并切胶回收。利用无缝克隆试剂盒对酶切后的lupI-MSSS基因片段和pET28a质粒进行连接。涂布含卡那霉素的LB平板，筛选转化子。挑取6个单克隆，在含卡那霉素的LB液体培养基中培养，收集菌体。提取质粒DNA，酶切验证。

1.2.6 抑制剂LupI-MSSS在大肠杆菌中的表达

将pET28a-lupI-MSSS重组表达载体转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，在含卡那霉素的LB平板上培养。挑取单克隆，在含有40 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，200 r/min，37 ℃培养12 h，1%接种量转接至两个三角瓶培养，当培养至OD600为0.4～0.6时，一瓶加入终浓度为0.4 mmol/L 的IPTG，37℃诱导，另一瓶不加IPTG作为对照，均继续培养6 h，离心，收集细胞。加入50 mmol/L pH 8.0的Tris-HCl缓冲液悬浮细胞，超声波破碎细胞，离心，弃沉淀，取上清液进行SDS-PAGE检测。

1.2.7 抑制剂LupI-MSSS诱导表达条件优化

1.2.7.1 诱导剂添加时间对LupI-MSSS产量的影响

按2%接种量接种，在37 ℃，200 r/min的条件下分别培养1、2、3、4、5、6 h，加入诱导剂IPTG进行诱导，并在每个时间段取样测大肠杆菌的菌浓OD600值，诱导完成后收集菌体，超声破碎后取上清检测，确定最佳诱导时间。

1.2.7.2 诱导剂浓度对LupI-MSSS产量的影响

按2%接种量接种，在最佳诱导时间加入诱导剂IPTG，调整使其终浓度分别为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mmol/L，诱导完成后收集菌体，超声破碎后取上清检测，分析不同终浓度的诱导剂对LupI-MSSS产量的影响，确定最佳诱导剂浓度。

1.2.7.3 诱导温度对LupI-MSSS产量的影响

按2%接种量接种，在最佳诱导时间加入诱导剂IPTG，调整使其终浓度为上述最佳诱导浓度，设置诱导温度分别为16、20、27、32、37、42、45 ℃，诱导完成后收集菌体，超声破碎后取上清检测，确定最佳诱导温度。

1.2.7.4 诱导时间对LupI-MSSS产量的影响

按2%接种量接种，在最佳诱导时间加入诱导剂IPTG，调整使其终浓度为最佳诱导浓度，在上述最佳温度条件下分别诱导2、4、6、8、10、12 h,诱导完成后收集菌体并破碎细胞，检测抑制剂活性，确定最佳诱导时间。

1.2.8 抑制剂LupI-MSSS纯化[12,13]

1.2.8.1 超滤

先用30 kDa的超滤膜收集滤出液，再用3 kDa超滤膜收集浓缩液，浓缩后样品通过SDS-PAGE检测[14]。

1.2.8.2 Superdex 200凝胶过滤层析

采用Superdex 200 pg 26/600凝胶柱，用50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)预平衡。将上述经超滤所得蛋白液过0.45 μm的滤膜，进行上样，上样量10 mL。同样的缓冲液进行洗脱，流速1 mL/min,检测波长为280 nm。分部收集洗脱后的溶液，测定与蛋白峰相对应的洗脱液的抑制活性，确定抑制活性最高的那部分洗脱液。

1.2.8.3 Q-Sepharose离子交换层析

采用Q-Sepharose FF, 20 mL层析柱，用50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)预平衡10个柱体积。将上述经Superdex 200凝胶过滤层析所得蛋白液过0.45 μm的滤膜，上样，上样量5 mL。用同样的缓冲液先将那些未吸附在层析柱上的蛋白洗脱出来；然后用1 mol/L NaCl溶液(50 mmol/L Tris-HCl缓冲液配制，pH 8.0)对吸附在层析柱的蛋白进行梯度洗脱，调节流速为1 mL/min，检测波长为280 nm。分部收集洗脱后的溶液，测定与蛋白峰相对应的洗脱液的抑制活性，确定活性峰。

1.2.9 抑制剂LupI-MSSS纯度测定

利用高效液相色谱法对纯化后的样品进行纯度分析。利用TSK3000SW凝胶过滤柱，在波长280 nm处检测。流动相为100 mmol/L的磷酸缓冲液,100 mmol/L Na2SO4,pH 6.5,流速为0.6 mL/min[15]。

2 结果与分析

2.1抑制剂LupI-MSSS原核表达载体的构建

pET28a-LupI-MSSSBL21扩大培养后提取质粒，并进行NcoI和SalI双酶切验证，结果见图1。其中泳道1为阳性质粒pET28a-LupI-MSSS酶切电泳结果，可以看出，酶切后表达片断大小约为363 bp，与预期大小相符。

1-LupI-MSSS质粒 M-DNA 1 kb ladder图1 LupI-MSSS质粒酶切图Fig.1 dentification of plasmid recombinant by restriction digesting

2.2抑制剂LupI-MSSS诱导表达结果

pET28a-LupI-MSSS重组表达载体转化表达，菌液离心弃上清，沉淀重悬超声破碎后，SDS-PAGE电泳检测，如图2所示，2泳道中明显有1条11 kDa左右的条带，与预测蛋白分子量相符，未加IPTG诱导的1几乎没有。而活性测定也表明2有活性，1没有抑制活性，说明抑制剂LupI-MSSS重组表达成功。

M-蛋白Marker；1-非诱导上清；2-IPTG诱导上清图2 LupI-MSSS在大肠杆菌中的诱导表达结果Fig.2 SDS-PAGE analysis of LupI-MSSS expressed by E．coli

2.3单因素法优化LupI-MSSS表达条件

2.3.1 诱导剂添加时间对LupI-MSSS产量的影响

诱导剂添加时间与菌体生长密度有关，诱导剂添加的过早，IPTG会抑制菌体增殖，细菌从生长阶段进入表达阶段，但由于菌体密度较低，因而蛋白表达量不高。诱导剂添加的越晚，菌体密度越高，但菌体相对较老，蛋白表达效率也会降低。如图3所示，当OD600在0.8左右时，即发酵液培养2 h后添加诱导剂IPTG时，相对抑制活性处于较高水平，之后随着时间的延长，抑制活性逐渐降低。因此，本试验确定诱导剂IPTG应在发酵液培养后的2 h(OD600=0.8)时添加。

图3 诱导剂添加时间对LupI-MSSS产量的影响Fig.3 The effects of IPTG addition time on the activity of LupI-MSSS

2.3.2 诱导剂浓度对LupI-MSSS产量的影响

诱导剂IPTG的浓度与蛋白表达的速度相关，在一定范围内高浓度的IPTG会加快蛋白的表达，但是IPTG具有一定的细胞毒性，浓度过高时会降低细胞的活性，抑制细胞增殖。从图4中可以看出,当诱导剂浓度在0.4～0.6 mmol/L范围内，抑制活性维持在相对较高的水平，当诱导剂终浓度为0.5 mmol/L时的相对抑制活性最大，因而确定添加诱导剂的终浓度为0.5 mmol/L。

图4 诱导剂浓度对LupI-MSSS产量的影响Fig.4 The effects of IPTG concentration on the activity of LupI-MSSS

2.3.3 诱导温度对LupI-MSSS产量的影响

在诱导表达时，较低的温度下菌体生长缓慢，蛋白表达的速率低，蛋白表达的时间延长。升高温度，菌体生长速度加快，表达速率提高，但温度过高时蛋白的表达受到抑制。如图5所示，37 ℃诱导时，LupI-MSSS表达量明显高于其他几个温度的表达量，故IPTG诱导抑制剂LupI-MSSS表达的最优温度选择37 ℃。

图5 诱导温度对LupI-MSSS产量的影响Fig.5 The effects of induction temperature on the activity of LupI-MSSS

2.3.4 诱导时间对LupI-MSSS产量的影响

考察不同诱导时间对产酶的影响结果如图6所示，当诱导时间为2～8 h时，菌体密度逐渐升高，蛋白合成旺盛，抑制剂活性随诱导时间的延长而提高，在8 h时达到最高值，当诱导时间超过8 h时，菌体由于生长时间过长而衰退，抑制活性开始逐渐降低，确定8 h作为该基因工程菌的最佳诱导时间。

图6 诱导时间对LupI-MSSS产量的影响Fig.6 The effects of induction time on the activity of LupI-MSSS

2.4抑制剂LupI-MSSS纯化结果

2.4.1 超滤

经过30 kDa滤膜过滤后，分子量较大的大部分杂蛋白被除去,用3 kDa超滤膜进行浓缩，发现仍有少量杂蛋白存在。

2.4.2 Superdex 200凝胶过滤层析

超滤浓缩后的样品过0.45 μm滤膜，用于Superdex 200凝胶过滤层析进行进一步的分离纯化，洗脱结果如图7所示，分部收集后的活性测定结果表明，只有第2个峰具有抑制活性。

图7 Superdex 200凝胶过滤层析Fig.7 Superdex 200 gel filtration chromatography

2.4.3 Q-Sepharose离子交换层析

Superdex 200凝胶过滤层析后的活性峰样品过0.45 μm滤膜，用于Q-Sepharose离子交换层析进行进一步的纯化。如图8所示，仅洗脱峰1有活性，目的蛋白的洗脱收集条件为0.6 mol/L NaCl。

图8 Q-Sepharose离子交换层析Fig.8 Q-Sepharose ion exchange chromatography

2.4.4 抑制剂LupI-MSSS纯化结果[12,16]

对LupI-MSSS粗蛋白进行3步纯化：超滤，Superdex 200凝胶过滤层析，Q-Sepharose离子交换层析，结果如表1所示，目的蛋白纯化倍数为20，比活力为15 720 U/mg,活性回收率为60.7%。

表1 大肠杆菌表达LupI-MSSS的纯化结果

2.4.5 SDS-PAGE电泳

1-粗蛋白；2-30 kDa滤出液；3-3 kDa浓缩液；4-Superdex 200；5-Q-Sepharose图9 LupI-MSSS纯化的SDS-PAGE结果Fig.9 SDS-PAGE analysis of purified LupI-MSSS

2.4.6LupI-MSSS纯度鉴定结果[15]

对纯化后的LupI-MSSS进行蛋白质纯度检测。在1.2.9色谱条件下，取验证试验洗脱峰样品溶液进样20 μL,保存色谱峰图。根据峰面积归一法，计算抑制剂LupI-MSSS的纯度。蛋白酶抑制剂LupI-MSSS经过高效液相色谱法检测后的纯度结果如图10。抑制剂LupI-MSSS表现为单一的色谱峰，峰型较为对称，分离纯度较好。经过峰面积归一法计算，其纯度高达99.7%。

图10 HPLC法纯度检测结果Fig.10 HPLC analysis of the purified lupI

3 结果与讨论

本文将扩增得到的编码LupI-MSSS的目的基因片段和pET28a原核表达载体进行连接转化并转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达，SDS-PAGE凝胶电泳结果表明，该蛋白的大小约11 kDa,与预测的蛋白分子质量一致。为提高LupI-MSSS的表达量，对影响蛋白表达的几个主要因素进行了优化，经初步优化得到了其诱导表达的条件为：诱导剂添加时间3 h，诱导剂IPTG终浓度0.5 mmol/L，诱导温度为37 ℃，诱导时间为8 h。在该条件下，抑制剂LupI-MSSS表达量较高，可发酵表达供后续纯化。对表达后的抑制剂进行纯化，纯化的步骤为：超滤，Superdex 200凝胶过滤层析，Q-Sepharose离子交换层析，3步纯化后目的蛋白纯化倍数为20，活性回收率达60.7%，纯度达99%以上，达到较好的预期纯化效果，且回收率较高。

对沙雷氏蛋白酶这一类酶与抑制剂相互作用研究较多的是一种来源于假单胞杆菌的碱性蛋白酶APR与其抑制剂APRin形成一个紧密结合的复合物[8]。通过研究这一复合物的晶体结构发现酶与抑制剂有两个结构在空间上相互接触，一个是连接抑制剂β折叠片IV和V之间的loop环连接，它与酶的Met转角区相互接触。另一个是N端trunk结构，该结构几乎成直线状伸入蛋白酶的β桶结构，并占据了酶的活性中心，阻止其他多肽底物进入酶的活性中心，从而抑制该蛋白酶的活性[17-18]。本研究制备了该抑制剂的高纯度蛋白，为进一步进行蛋白结构生物学研究提供了扎实的技术储备。在此基础上，开展晶体优化培养、蛋白结构生物学和基因功能机制研究，将对我们揭示酶与抑制剂相互作用的结构基础和深入了解沙雷氏蛋白酶的分泌调控机理发挥重要作用。

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ConstructionofprokaryoticexpressionvectorforexpressionandpurificationofinhibitorlupI-MSSS

WANG Kun1,2,LIANG Peng-juan1,LI Shang-yong1,WANG Wei1, SUN Jing-jing1,LIU Jun-zhong1,SUN Mi1,HAO Jian-hua1*

1(Key Laboratory of Polar Fisheries Development, Laboratory for Marine Drugs and Bioproducts，Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology,Yellow Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences Qingdao 266071, China) 2(College of Food Sciences & Technology,Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

The alkaline metalloproteases MP is extracted from the strain YS-80-122 and belongs to the family of serralysin. Similarly to the other enzymes of this family reported before,there is an inhibitor genelupIdownstream of the MP gene andLupIcan completely inhibit the activity of MP.On the basis of the wild-type inhibitor gene, four amino acids were added to the N-terminus ofLupI, namedLupI-MSSS.This work aims to construct a prokaryotic expression vector forLupI-MSSS, the recombinant plasmid was transformed to BL21 (DE3), and the expression was induced by IPTG. The recombinationLupI-MSSSwas separated using SDS-PAGE and the size of expressedLupI-MSSSwas consistent with the prediction. Single factor experiment were used to optimize the fermentation condition and the optimal conditions were :the inoculation amount is 2 %, IPTG as the induced agent was added at 3 h after inoculating, and it's final concentration is 0.5 mmol/L, the recombined E.coli need inducing 8 hours at 37 ℃.Consecutive steps were used to achieve the purified protein as follows: ultrafiltration, Q Sepharose ion exchange, Superdex 200 gel filtration, and the purity of LupI-MSSS is up to 99%.

inhibitor of protease; prokaryotic expression; purification

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014069

硕士研究生(郝建华研究员为通讯作者,E-mail:haojh@ysfri.ac.cn)。

国家自然科学基金(41376175)；国家实验室-鳌山科技计划(2016ASKJ14)

2017-02-16，改回日期：2017-04-09