使用稀禾定驯化提高裂殖壶菌的生长和DHA积累

王康，刘良森，陈磊，张卫文

(天津大学 化工学院，天津，300350)

使用稀禾定驯化提高裂殖壶菌的生长和DHA积累

王康，刘良森，陈磊*，张卫文

(天津大学 化工学院，天津，300350)

采用基于实验室的微生物适应性驯化方法，对Schizochytriumsp. S31进行脂肪酸合成途径抑制剂稀禾定连续传代驯化，逐步提高稀禾定的驯化浓度。经过近200天连续驯化65代，Schizochytriumsp. S31对稀禾定的耐受浓度从200 μmol/L提高到了500 μmol/L。通过250 mL摇瓶发酵96 h后发现，驯化株的生物量明显高于野生株的生物量，其中驯化株ALE500的生物量最高，比相同时间点野生株的生物量高20.2%，二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid, DHA)产量也提高了30.4%。此外，驯化株的脂肪酸不饱和度也有所提高，其中驯化株ALE500的不饱和度达到了1.11。采用5 L发酵罐验证驯化效果，结果显示驯化株ALE500的生物量和DHA产量分别提高了19.74%和29.38%。综上所述，使用脂肪酸合成途径抑制剂稀禾定对裂殖壶菌进行定向驯化的方法可以提高裂殖壶菌的发酵生物量和DHA产量。

裂殖壶菌；稀禾定；驯化；生物量；DHA

二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid, DHA)是一种ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3 PUFAs)，具有预防和治疗心血管疾病、健脑益智和提高记忆力、改善视网膜功能和提高视力、抗癌、抗过敏等重要生理功能[1-3]。比较传统鱼油来源的DHA，一些海洋微生物油脂中的DHA含量更高[4]，且海洋微生物具有种质资源丰富、培养简单可控、脂肪酸组成简单、不含鱼腥味等优点而成为可以替代鱼油的重要DHA来源。其中，裂殖壶菌因生长速度快、油脂含量高、DHA含量高且无毒副作用、易于培养、易于纯化等优点而成为一种有潜力的生产DHA的种质资源。

为了提高裂殖壶菌的发酵生物量，克服裂殖壶菌在长期的保存及使用过程中由于退化导致的发酵生物量低的缺点，以往研究主要集中在培养基配方、培养条件、发酵工艺以及遗传改造等方面[5-7]，但是DHA 产量和质量仍有较大的提升空间[8]。由于微生物有快速适应不同环境的能力，基于实验室的微生物适应性驯化(Adaptive Laboratory Evolution, ALE)已经越来越被推崇为一种筛选并富集有利突变进而可以获得高活性或高抗性菌株的重要方法[9]。

乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase, ACCase)可以催化乙酰辅酶A生成丙二酸单酰辅酶A，此反应是脂肪酸合成的限速步骤[10]。而稀禾定(sethoxydim, 2-[1-(乙氧基亚氨基)丁基]-5-[2-(乙硫基)丙基]-3-羟基-2-环己烯-1-酮)是该酶的抑制剂(包括但不限于稀禾定)[11]。DONG[11]使用泛素启动子在玉米细胞中过量表达狐尾粟胞内的ACCase基因，使得稀禾定对玉米的损伤指数降低到33%，玉米油脂含量从24%提高到65%；SARA[12]在经过7 000多次实验后证实，稀禾定可以杀死产油效率低的藻类植物，同时也能促进产油效率高的藻类植物快速生长。这表明稀禾定在海洋微藻产油方面具有筛选与促进的双重作用。作为原始的真核植物细胞，裂殖壶菌与植物有着密切的进化关系[13]。在裂殖壶菌的培养基中添加稀禾定同样会抑制细胞生长，于是推测稀禾定也是通过抑制裂殖壶菌的脂肪酸合成而导致其衰弱甚至死亡的。本研究中，我们以Schizochytriumsp. S31为研究对象，采用适应性驯化的方法对其进行稀禾定驯化，提高其对稀禾定的耐受性，从而提高裂殖壶菌的发酵生物量和DHA产量。

1 材料与方法

1.1菌种

裂殖壶菌(Schizochytriumsp. S31)，购自广东微生物菌种保藏中心。

1.2主要试剂

十九烷酸甲酯(Methyl nonadecanoate，内标)、二十二碳六烯酸甲酯(Docosahexaenoic acid methylester, DHA-ME，外标)、2-[1-(乙氧基亚氨基)丁基]-5-[2-(乙硫基)丙基]-3-羟基-2-环己烯-1-酮(稀禾定，Sethoxydim，纯度≥98%)：色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司；苯酚、亚硝基铁氰化钠：分析纯试剂，天津江天化工公司；葡萄糖测定试剂盒：中生北控公司。

1.3主要仪器

7890A/5975CAgilent气相色谱与质谱联用仪，Agilent公司；5430R Eppendorf台式高速冷冻离心机，Eppendorf公司；LGJ-10冷冻干燥机，松源华兴公司；ELX-808 96孔板扫描仪，基因公司；UV-1750紫外可见分光光度计，日本岛津公司；LWG-L96真空干燥离心机，湘仪离心机仪器公司；Forma 702 超低温冰箱，Thermo公司。

1.4培养基

种子培养基(g/L)：葡萄糖5.0，酵母粉1.0，蛋白胨1.0，海盐20.0，pH 6.5；

发酵培养基(g/L)：葡萄糖40.0，酵母粉10.0，蛋白胨5.0，海盐20.0，pH 6.5。

以上培养基均在1×105Pa压力下灭菌30 min。

1.5方法

1.5.1 培养方法

种子发酵培养：一级液体种子发酵培养：50 mL种子培养基装于250 mL三角瓶中，从斜面保藏菌种挑取单菌落接种于液体培养基，25 ℃、180 r/min培养2 d。二级液体种子发酵培养：100 mL种子培养基装于500 mL三角瓶中，从一级种子液中按照接种量5%(v/v)取液体菌种，接种于灭菌的二级发酵培养基中，25 ℃、180 r/min培养2 d得二级种子液，进入5 L发酵罐。

摇瓶发酵培养：从一级液体种子中取种子液，接种于装有50 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，使起始OD660为0.4，25 ℃、180 r/min培养4 d。所有发酵培养基均未添加稀禾定，且每组做3个平行样，定点取样用于后续分析测定。

5 L反应器补料分批发酵：初始葡萄糖浓度为40 g/L，装液量为2 L，接种量10%(v/v)，培养温度25 ℃，通气为1.0 L/(L·min)，通过控制转速使溶氧控制在30%以上。通过添加NaOH，维持pH在6.5 ± 0.1，消泡剂选用50 g/L生工Foam-free powder。发酵过程中每隔一定的时间取样测定葡萄糖浓度、氨态氮浓度、生物量、油脂含量以及DHA含量。通过添加60%的葡萄糖控制罐内葡萄糖质量浓度在10 g/L以上。在发酵24 h后，为了防止补料发酵过程中的氮源限制向发酵液中流加酵母粉10 g。

1.5.2 驯化方法

取少量Schizochytriumsp. S31菌液涂布于含有10、50、100、200、300 μmol/L不同浓度稀禾定的固体种子培养基上，正常条件下进行培养，同时以未添加稀禾定的固体平板作为对照。根据平板上的菌落长出情况，确定稀禾定的抑制浓度为200 μmol/L。驯化过程中控制接种到培养基后的菌液浓度OD660为0.4，添加一定浓度的稀禾定，培养至OD660为10左右后传代，仍然控制起始接种OD660为0.4。在传代的过程中，待驯化株的长势由缓慢变正常后以50 μmol/L的增幅逐渐增大稀禾定的浓度，每一个特定稀禾定浓度持续几代至十几代不等。

1.5.3 耐受性测定

在四分格培养皿中依次倒入5 mL分别含有0、200、350、500 μmol/L稀禾定的固定种子培养基。待其凝固后，分别取野生株和驯化株ALE500在每格的固体培养基上进行划线。将其置于25 ℃培养箱中培养，48 h后取出进行分析比较。

1.5.4 分析方法

生物量的测定：取3 mL发酵液置于已称重的离心管中，7 500 r/min离心5 min，弃上清后，用pH 6.5的PBS溶液洗涤2次，置于-80 ℃冰箱中冻结细胞，后用冷冻干燥机冻干至恒重(约24 h)后称重。

残糖的测定：收集上步离心后的上清液，双蒸水稀释30倍，按照葡萄糖测定试剂盒(葡萄糖氧化酶法)使用说明书进行测定[14]。

氨态氮的测定：靛酚蓝-分光光度法[15]。

总油脂的测定：有机溶剂萃取方法[16]。

脂肪酸含量的测定[17]：称取冻干后的菌体100 mg，加入2 mL氯仿和2 mL酯化液(含有3%(v/v)浓硫酸和2.5 g/L十九烷酸甲酯(作为内标)的甲醇溶液)，在100 ℃下酯化2 h，取出后冷却至室温，加入1 mL双蒸水。充分振荡后静置至溶液分层，取下层溶液在气相色谱与质谱联用仪Agilent 7890A/5975C中检测。气相色谱条件：色谱柱：HP-5MS，载体为氮气，分流比为30∶1。升温程序为：起始温度80 ℃并停留2 min，以10 ℃/min的速度升至300 ℃并停留20 min。质谱扫描范围为：35～650 amu。质谱结果通过NIST2002数据库检索比对，各组分含量由归一化法定量。DHA的定性分析：在上述气相色谱条件下，用已知的DHA甲酯标准品色谱峰的保留时间与样品甲酯化后脂肪酸甲酯各组分色谱峰的保留时间对照进行分析。

1.5.5 统计分析

使用SPSS软件对实验数据进行t检验分析差异性。以野生型数值作为对照，P<0.005，表明与野生型的差异极显著；P<0.01，表明差异非常显著；P<0.05，表明差异显著。

2 结果和分析

2.1裂殖壶菌的稀禾定驯化曲线及耐受性测定

鉴于稀禾定作为乙酰辅酶A羧化酶的抑制剂，在本研究中，以Schizochytriumsp. S31为研究对象，选定稀禾定作为驯化剂，采用适应性驯化的方法对其进行稀禾定驯化，如图1所示。

图1 稀禾定驯化裂殖壶菌曲线图Fig.1 Laboratory evolution of sethoxydim tolerance in Schizochytrium sp. S31

经过约200天65代的连续驯化，裂殖壶菌对稀禾定的耐受浓度逐渐提高到了500 μmol/L，是起始驯化浓度的2.5倍。但是随着稀禾定浓度的增大，驯化株达到平台期的时间逐渐延长，且在当前浓度下的传代次数随之增多。在提高稀禾定驯化浓度之前对可在当前浓度下稳定遗传的驯化株进行保种。分别取野生株(Wild type)、耐200 μmol/L稀禾定的驯化株(ALE200)、耐300 μmol/L稀禾定的驯化株(ALE300)、耐400 μmol/L稀禾定的驯化株(ALE400)和耐500 μmol/L稀禾定的驯化株(ALE500)用作后续分析实验。为了验证驯化株对稀禾定的耐受性，设计了平板表型验证实验。如图2(a)、(b)所示，野生株只在不含稀禾定和含200 μmol/L稀禾定的平板上生长，且在含200 μmol/L稀禾定的平板上的菌落数明显少于不含稀禾定的对照组。而驯化株ALE500却可以在含以上所有浓度稀禾定的平板上生长，但是由于高浓度稀禾定的胁迫，稀禾定浓度越高，菌落数越少。由此结果得出，通过稀禾定驯化确实提高了裂殖壶菌对稀禾定的耐受性。

0：c(稀禾定)= 0 μmol/L；200：c(稀禾定)= 200 μmol/L；350：c(稀禾定)= 350 μmol/L；500：c(稀禾定)= 500 μmol/L图2 裂殖壶菌野生株(a)和驯化株ALE500(b)的平板表型验证Fig.2 Phenotype validation of wild type (a) and evolved strain ALE500 (b) on plate

2.2不同裂殖壶菌驯化菌株的摇瓶发酵性能差异比较

将上述5株不同的裂殖壶菌菌株接入相同的发酵培养基中，按照1.5.1的培养条件进行培养，探讨其摇瓶发酵性能的差异。不同菌株的生长曲线如图3所示，前24 h是菌体生长的适应期，菌株之间差别不明显。24 h之后，菌体生长便进入指数生长期，菌株之间的差别逐渐拉大。驯化菌株的生长速率明显高于野生株，且随着驯化菌株耐受浓度的增大，生长速率也逐渐增大。和野生株相比，驯化菌株的耗糖和耗氮速率明显加快，且总耗糖量和总耗氮量也明显增多(图3)。

图3 裂殖壶菌野生株和驯化株生长曲线Fig.3 The growth curves of wild type and four evolved strains

其中，野生株96 h的总耗糖量为33.41 g/L，而驯化株ALE500的总耗糖量却达到了38.02 g/L。如表1所示，驯化株的最大比生长速率呈依次增大的趋势，其中驯化株ALE500的最大比生长速率0.356比野生株的最大比生长速率0.294高21.1%。由于在相同的发酵周期，驯化株的生物量比野生株的高，因此驯化株的干重产率也高于野生株。摇瓶发酵野生株和不同驯化株72 h后，驯化株ALE500的干重产率达到了0.20 g/(L·h)，而野生株仅为0.17 g/(L·h)，ALE500驯化株的干重产率是是野生株的1.18倍(表1)。以上实验结果均表明，通过稀禾定驯化裂殖壶菌可以有效提高裂殖壶菌的发酵生物量，进而可以获得高DHA产率的驯化菌株。

表1 裂殖壶菌野生株和驯化株摇瓶发酵特性

注：***：P<0.005；**：P<0.01；*：P<0.05.

2.3不同裂殖壶菌驯化菌株的脂肪酸分布

C14∶0，C15∶0，C16∶0，C17∶0及C18∶0是裂殖壶菌胞内主要的饱和脂肪酸，二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic Acid, EPA)和DHA则是主要的不饱和脂肪酸。针对不同裂殖壶菌驯化株及野生株的脂肪酸成分分析表明，在几株驯化株与野生株中，DHA占总脂肪酸的含量没有显著变化(表2)。然而由表1所示，驯化株ALE500的DHA产量达到了2.23 g/L，与野生株的1.71 g/L相比，其差异显著性水平P<0.005，这表明高浓度的稀禾定驯化可以显著提高裂殖壶菌的DHA产量。同时，驯化株ALE500的PUFA/SFAs值达到了1.11，是野生株的1.13倍，其差异显著性水平0.005

表2 裂殖壶菌野生株和驯化株脂肪酸成分对比

2.4野生株与驯化株的补料分批发酵比较

为了验证裂殖壶菌驯化株的高生长能力，将野生株和驯化株ALE500分别应用到5 L发酵罐中进行扩大培养，结果如图4(a)所示。

图4 裂殖壶菌野生株和驯化株耗糖(a)和耗氮(b)速率Fig. 4 The glucose (a) and ammonium nitrogen (b) consumption of wild type and four evolved strains

虽然野生株和驯化株ALE500的生物量在细胞指数生长期都快速增长，但是驯化株的生物量增长速率要明显高于野生株。其中在发酵84 h时，驯化株ALE500的生物量比同一时间点野生株的生物量高21.6%。84 h之后，生物量继续增长，随后便进入细胞生长平台期(>96 h)，驯化株ALE500的细胞干重达到了52.6 g/L。比野生株高19.74%(表3)。虽然在整个发酵过程中，野生株和驯化株ALE500的油脂含量差别不大，但是驯化株ALE500的油脂产量却明显高于野生株(图4(a))。发酵60 h后，随着生物量的增长，驯化株ALE500呈现出了较野生株更强的油脂积累能力。驯化株ALE500的油脂产量最大达到了28.01 g/L，比野生株提高了24.43%(表3)。驯化株ALE500的DHA占总脂肪酸含量持续增长，最终达到了53%，比野生株提高了3.92%。和野生株相比，驯化株ALE500实现了更高的DHA产量，最高在发酵120 h时达到了11.14 g/L，比野生株高29.38%。以上结果均表明，经过稀禾定驯化得到的驯化株，其发酵生物量和DHA产量均有所提高。

图5 裂殖壶菌野生株和驯化株ALE500补料分批发酵过程中生物量和总油脂(a)、DHA占总脂肪酸含量和DHA产量(b)的变化比较曲线Fig. 5 Comparisons between wild type and evolved strain ALE500 for biomass and total lipids(a), DHA percentage in total fatty acids and DHA yield(b) in fed-batch fermentation

表3 裂殖壶菌野生株和驯化株ALE500的补料分批发酵参数比较

注：***：P<0.005；：P<0.01；*：P<0.05.

3 讨论

菌种的生物量低、易退化和不稳定已成为DHA发酵产率低的主要因素。为了克服以上缺点，一方面，传统的菌种改造技术将继续为生物发酵提供简单易行的工业菌株改造手段。比如：YAN[19]等把大肠杆菌中的乙酰辅酶A合成酶(acetyl-CoA synthetase, ACS)基因整合到裂殖壶菌Schizochytriumsp. TIO1101的基因组上，通过过量表达外源ACS基因，可以提高裂殖壶菌的生长速率和耗糖速率，最终实现生物量和脂肪酸含量分别提高了29.9%和11.3%；另一方面，基于实验室的微生物驯化方法得到对某一胁迫有高耐受性的菌株，结合基因组重测序、转录组学、蛋白组学或代谢组学的研究，在整体水平上得到与耐受性相关的基因、mRNA、蛋白、代谢物等其他的遗传或代谢基础，从而为后续基因工程改造高产菌株提供科学依据和靶点[20]，然而这在裂殖壶菌驯化研究中还没有相关报道。

稀禾定作为一种环己二酮类除草剂，是乙酰辅酶A羧化酶的抑制剂。如果将其添加到微藻培养基中，ACCase活性较弱的细胞衰弱甚至死亡，而ACCase活性较强的细胞可以生长。以此为出发点，尝试在裂殖壶菌培养基中添加稀禾定，采用基于实验室的微生物适应性驯化的方法对Schizochytriumsp. S31进行稀禾定驯化，逐步提高其对稀禾定的耐受性，从而可以获得ACCase活性较强的驯化株。为了验证驯化株对稀禾定的耐受性，设计了平板表型验证，结果表明Schizochytriumsp. S31对稀禾定的耐受性确实有了大幅度的提高。通过补料分批发酵比较裂殖壶菌野生株与驯化株ALE500的生长及发酵特性，裂殖壶菌驯化株ALE500的生物量比野生株提高了19.74%，油脂产量提高了24.43%，DHA产量提高了29.38%。另外，本研究把裂殖壶菌对稀禾定的耐受浓度只提高到了500 μmol/L，将来仍然可以继续对其进行驯化，以得到生物量更高的裂殖壶菌。

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ImprovinggrowthandDHAproductionofSchizochytriumsp.bysethoxydim-basedadaptiveevolution

WANG Kang, LIU Liang-sen, CHEN Lei*, ZHANG Wei-wen

(School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300350, China)

Laboratory-based adaptive evolution was applied to increase the tolerance to ACCase inhibitor sethoxydiminSchizochytriumsp. S31. Through an experimental evolution process of continuous 65 passages for 200 days, the sethoxydim tolerance concentration inSchizochytriumsp. was increased from 200 μmol/L to 500 μmol/L. After 96 h fermentation in shake flasks, a comparative analysis of wild type and evolved strains showed that the biomass of the final evolved strain ALE500 reached 14.7 g/L at 72 h, which was 20.2% higher than that of wild type. In addition, docosahexaenoic acid (DHA) yield was increased by 30.4% in the evolved strain compared with the wild type. Moreover, the unsaturation degree of total fatty acids was also significantly increased in the evolved strain ALE500 and reached 1.11. To further verify the domestication effect of evolved strain, fed-batch strategy was applied and 19.74% increase of biomass and 29.38% increase of DHA yield were observed. This study demonstrated that the application of the sethoxydim-tolerance increased the biomass accumulation and DHA production inSchizochytriumsp. S31.

Schizochytriumsp.； Sethoxydim；adaptive evolution; growth; docosahexaenoic acid (DHA)

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014107

硕士研究生(陈磊副教授为通讯作者,E-mail:lchen@tju.edu.cn)。

国家自然科学基金(21621004)；国家“973”计划(2014CB745101)；高等学校博士学科点专项科研基金(20120032110020、20130032120022)；天津市应用基础与前沿技术研究计划(15JCZDJC32500)

2017-02-21，改回日期：2017-03-22