α-硫辛酸对糖调节受损大鼠认知功能和氧化应激影响的初步研究

周丽娜， 王洪新， 梁佩芬， 程 焱

α-硫辛酸对糖调节受损大鼠认知功能和氧化应激影响的初步研究

周丽娜1， 王洪新1， 梁佩芬1， 程 焱2

目的 研究硫辛酸对糖调节受损大鼠认知功能和氧化应激的影响。方法 雄性Wistar大鼠随机分为5组，对照组、模型组、硫辛酸低[15 mg/(kg·d)]、中[30 mg/(kg·d)]、高[60 mg/(kg·d)]剂量组。用高脂高糖饲料饲养法建立糖调节受损大鼠模型，给予成功的大鼠模型连续每日灌胃硫辛酸溶液15 mg/kg、30 mg/kg、60 mg/kg，每日一次，共14 d。用Morris水迷宫法检测大鼠学习记忆能力；用流式细胞仪检测各组大鼠海马组织的ROS含量值。结果 与对照组相比，模型组大鼠学习记忆能力下降(P<0.05)，海马组织内ROS水平升高(P<0.05)；与模型组相比，硫辛酸组脑内ROS水平下降，大鼠的学习和记忆能力提高，尤以中剂量组改变明显(P<0.05)。结论 α-硫辛酸对糖调节受损大鼠的认知功能有保护作用，该保护作用与其抗氧化作用有关。

糖调节受损； α-硫辛酸； 认知功能； 氧化应激

糖尿病是产生认知障碍的相对独立而重要的危险因素[1]。而研究表明，氧化应激是引起糖尿病的发生及发展的重要因素[2]。糖调节受损(impaired glucose regulation，IGR)是糖尿病的前期状态，目前对于糖调节受损阶段的认知障碍研究仍较少。α-硫辛酸(α-lipoic acid,ALA)是存在于线粒体α-酮酸氧化脱氢酶系中一个重要的辅助因子，作为强而有效的抗氧化剂被广泛使用，主要通过清除体内的氧自由基和动员机体内源性的抗氧化剂的生成发挥作用[3]。目前ALA主要应用于糖尿病外周神经病变，并获得了良好的疗效，但ALA能否改善糖调节受损大鼠的认知功能障碍，相关的临床报道很少。

本研究建立糖调节受损大鼠模型，测定其认知功能、氧化应激水平，并研究硫辛酸对认知功能和氧化应激的影响。

1 材料与方法

1.1 动物分组和模型制备 SPF级Wistar雄性大鼠，体质量180～220 g，由北京维通利华实验动物有限公司[动物许可证号：SXCK(京)2002-0003]提供。大鼠在标准环境饲养，室温20 ℃～28 ℃，24 h昼夜循环光照，自由饮水进食。将大鼠随机分为对照组30只、模型组100只。100只模型组随机取80只成功模型组再随机分为模型组和硫辛酸低、中、高剂量干预组，每组20只。故本实验总共分为5组，对照组20只，模型组20只，硫辛酸低、中、高剂量干预组各20只。对照组给予普通饲料；模型组及硫辛酸组给予高脂高糖饲料。两组大鼠每日均喂食3次，按每只20 g/日投放饲料，共饲养17 w。第14周进行一次葡萄糖耐量试验。空腹血糖6.2～7.5 mmol/L或者餐后2 h血糖7.9～10.4 mmol/L为造模成功标准[4]。饲养14 w后，硫辛酸低、中、高剂量组于成功模型大鼠分别连续每日灌胃硫辛酸溶液15 mg/kg、30 mg/kg、60 mg/kg，每日一次，共14 d。对照组和模型组每日灌胃蒸馏水。

1.2 行为学检测 饲养第17 w时，取各组大鼠用Morris水迷宫法[5]进行学习记忆功能测定。先通过4 d的训练让大鼠熟悉并游至平台上。第5天隐藏平台,通过记录分析系统分析处理潜伏期,考察学习能力。第6天撤去平台,进行空间搜索实验-去除平台观察2 min内大鼠在中心区停留时间百分比和通过原平台位置次数,测试记忆能力。

1.3 活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)检测 Morris水迷宫试验结束后，每组大鼠麻醉后断头取脑，冰盘上快速分离海马，用眼科剪将海马组织剪碎，轻轻研磨组织后经300目筛网过滤，制备单细胞悬液，然后在室温下4000 r/min离心3 min，弃上清后加入二氯二氢荧光素-乙酰乙酸醋(2’,7’- dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA)工作液，37 ℃避光孵育20 min后应用FACS Aria II流式细胞仪，每个样本收集104个细胞，以DCF的荧光强度作为ROS含量值。

2 结 果

2.1 糖调节大鼠成模情况 模型组大鼠14 w时成模率为80%，无死亡大鼠。

2.2 认知功能评定情况 模型组大鼠逃避潜伏期较对照组延长(P<0.05),穿越目标区次数较对照组减少(P<0.05)；硫辛酸各干预组大鼠与模型组相比，逃避潜伏期缩短(P<0.05)，穿越目标区次数较对照组增加(P<0.05)，尤以中剂量组改变明显(P<0.05)，结果(见表1)。

2.3 治疗前后氧化应激水平比较 与对照组比较，模型组大鼠海马组织中ROS增高(P<0.05)，α-硫辛酸各干预组大鼠海马组织中ROS低于模型组，尤以中剂量组降低明显(P<0.05)，结果(见表2)。

表1 大鼠学习记忆能力

与正常对照组比较*P<0.05；与模型组比较#P<0.05；与硫辛酸中剂量组比较△P<0.05

表2 大鼠海马组织中ROS水平

与正常对照组比较*P<0.05；与模型组比较#P<0.05；与硫辛酸中剂量组比较△P<0.05

3 讨 论

糖调节受损即糖尿病前期，主要包括空腹血糖受损(impaired fasting glucose，IFG)和糖耐量受损(impaired glucose tolerance，IGT)。糖尿病、高血压病等血管性因素与认知功能下降及痴呆相关，当患者处于糖尿病前期即糖调节受损阶段时，就已经存在血管病变[6,7]。因此，推测糖尿病前期对认知功能可能有损害，但目前临床研究较少。本研究通过建立糖调节受损大鼠模型，通过Morris水迷宫法评价大鼠的认知功能，结果显示模型组大鼠较对照组大鼠学习记忆能力下降，说明在糖尿病前期即糖调节受损阶段大鼠已出现认知功能损害。

氧化应激是指机体在内外环境有害刺激的条件下，促氧化与抗氧化之间的平衡失调导致体内活性氧族(reactive oxygen species，ROS)的生成增加和(或)清除ROS的能力降低，ROS所引起的细胞和组织的生理和病理反应。Brownlee[8]曾提出糖尿病血管并发症产生的“统一机制”学说，其核心为线粒体电子呼吸链中因高血糖诱导产生过量的ROS，引起血管内皮细胞损伤，激活多条糖代谢旁路，最终导致包括糖尿病周围神经病变、糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病、大血管病变、心肌病等在内的糖尿病慢性并发症的发生，即氧化应激是高糖损伤共同基础。既往关于高血糖所致认知障碍及氧化应激水平的研究主要集中在糖尿病形成后[9,10]，糖尿病前期认知障碍与氧化应激水平的相关性研究仍较少。在糖尿病前期阶段,由于已存在糖代谢、脂质代谢、胰岛素代谢及动脉粥样硬化的各种病理生理机制异常，我们推测在糖尿病前期可能已经存在认知障碍及氧化应激的异常变化，且三者之间可能存在一定的相关性。本研究结果显示，糖调节受损模型大鼠海马组织内ROS水平升高，表明存在脑组织氧化应激损伤。证实氧化应激在糖调节受损中起重要作用，为临床应用抗氧化冶疗提供了实验依据。

α-硫辛酸(alpha-lipoic acid,ALA)是1951年由Reed首次从猪肝中分离出来的天然产物[11]，其在体内吸收进入细胞后，可还原成二氢硫辛酸并释放到细胞外。因此单独给予α-硫辛酸后，在体内以α-硫辛酸和二氢硫辛酸两种形式存在，它们协同作用，共同组成一种“万能抗氧剂”，有水溶性、脂溶性和分子量小等特点，口服和静脉途径给药都可以良好吸收，可以透过血脑屏障。ALA 是线粒体α-酮酸氧化脱氢酶的一个辅助因子，通过清除体内的氧自由基和动员机体内源性的抗氧化剂如维生素C、维生素E和谷胱甘肽的生成发挥作用[12]。近几年主要应用于糖尿病外周神经病变，并获得了良好的疗效，但是否能够改善糖调节受损大鼠的认知功能障碍，未见临床报道。本研究结果显示，ALA通过抗氧化途径降低了脑内ROS水平，改善了大鼠的空间学习和记忆能力。抗氧化策略有可能成为治疗糖调节受损中认知功能障碍的新途径。

综上所述，本研究通过观察糖调节受损大鼠的认知功能和海马组织的氧化应激水平，为糖调节受损导致认知障碍的氧化应激机制提供了理论依据，为血管性认知障碍的治疗提供新的途径。

[1]Dash SK.Cognitive impairment and diabetes[J].Recent Pat Endocr Metab Immune Drug Discov,2013,7(2):155-165．

[2]Fardoun RZ.The use of vitamin E in type 2 diabetes mellitus[J].Clin Exp Hypertens,2007,29(3):135-148.

[3]Jones W,Li X,Qu ZC,et al.Uptake,recycling,and antioxidant actions of alpha lipoic acid in endothelial cells[J].Free Radic Biol Med,2002,33(1):83-93.

[4]王 竹,杨月欣,向雪松,等.实验大鼠血糖正常范围的估算[J].卫生研究,2010,39:133-142.

[5]王俊亚,张东梅．Morris水迷宫实验的测试方法介绍及注意事项[J].现代医药生物,2012,28:3289-3290．

[6]Rizza S,Cardellini M,Porzio O,et al.Pioglitazone improves endothelial and adipose tissue dysfunction in pre-diabetic CAD subjects[J].Atherosclerosis,2011,215(1):180-183.

[7]Rizza S,Cardellini M,Martelli E,et al.Occult impaired glucose regulation in patients with atherosclerosis is associated to the number of affected vascular districts and inflammation[J].Atherosclerosis,2010,19(1):316-320.

[8]Brownlee M.The pathobiology of diabetic complications:a unifying mechanism[J].Diabetes,2005,54(6):1615-1625．

[9]Li X,Qi Z,Zhao L,et al.Astaxanthin reduces type 2 diabetic-associated cognitive decline in rats via activation of PI3K/Akt and attenuation of oxidative stress[J].Molecular Medicine Reports,2016,13(1):973.

[10]Patel SS,Gupta S,Udayabanu M.Urtica dioica modulates hippocampal insulin signaling and recognition memory deficit instreptozotocin induced diabetic mice[J].Metabolic Brain Disease,2016,31(3):601-611.

[11]Reed LJ,Debusk BG,Gunsalus IC,et al.Crystalline α-lipoic acid:A catalytic agent associated with pyruvate dehydrogenase[J].Science,1951,114:93.

[12]Jones W,Li X,Qu ZC,et al.Uptake, recycling,and antioxidant actions of alpha lipoic acid in endothelial cells[J].Free Radic Biol Med,2002,33(1):83-93.

A preliminary study of the effects of α-lipoic acid on cognitive function and oxidative stress in rats with impaired glucose regulation

ZHOU Lina,WANG Hongxin，LIANG Peifen，et al.

(Department of Neurology，the Affiliated Fourth Centre Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin 300140，China)

Objective To study the effects of lipoic acid on cognitive function and oxidative stress in rats with impaired glucose regulation.Methods Male Wistar rats were randomly divided into 5 groups:control group,model group,lipoic acid low 15 mg/(kg/d),medium 30 mg/(kg/d),high 60 mg/(kg/d) dose group.A rat model of impaired glucose regulation was established by feeding with high fat and high sugar diet.The model rats were fed with lipoic acid solution 15,30 and 60 mg/kg daily,1 times daily,with a total of 14 d.The learning and memory abilities of rats were measured by Morris water maze method,and the content of ROS in hippocampus of rats in each group was detected by flow cytometry.Results Compared with the control group,the learning and memory ability of the model group decreased (P<0.05),while the level of ROS in the hippocampus increased (P<0.05).Compared with the model group,the level of ROS in the brain decreased in the lipoic acid group,and the learning and memory ability of the rats increased,especially in the middle dose group (P<0.05).Conclusion Lipoic acid has protective effects on cognitive function in rats with impaired glucose regulation,and its protective effects are related to its antioxidant effects.

Mpaired glucose regulation； α-lipoic acid； Cognitive function； Oxidative stress

2017-04-09；

2017-05-30

(1.天津医科大学第四中心临床学院神经内科，天津 300140;2.天津医科大学总医院神经内科，天津 300052)

程 焱，E-mail：cylfl@sohu.com

1003-2754(2017)08-0700-03

R741.05

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