解偶联蛋白2基因-866G/A,Ala55Val及Ins/Del多态性对宁夏回族人群血清抗氧化物质含量的影响分析

梁雪云, 姚子昂, 马斌武， 金毅然， 韩怀钦， 牛建国,5, 何仲义

解偶联蛋白2基因-866G/A,Ala55Val及Ins/Del多态性对宁夏回族人群血清抗氧化物质含量的影响分析

梁雪云1, 姚子昂2, 马斌武3， 金毅然1， 韩怀钦4， 牛建国4,5, 何仲义4

目的 以宁夏地区回族人群为研究对象，分析UCP2基因多态性对血清抗氧化物质含量的影响。方法 收集宁夏地区回族正常人群及回族脑缺血患者外周血样本，提取外周血基因组DNA，采用聚合酶链反应-限制性片断长度多态性方法检测各样本UCP2基因-866G/A、Ala55Val及Ins/Del多态性，利用试剂盒检测血清抗氧化物质SOD、TAOC、GSH含量。结果 宁夏地区回族健康人群中，UCP2基因-866位点GA基因型血清GSH值(125.78±4.55)U/L低于GG野生型基因型GSH值(130.35±10.68)U/L(P<0.05)；脑缺血患者中Ins/Del位点组Ins/Ins基因型血清GSH值(108.71±8.30)U/L低于Del/Del基因型血清GSH值(116.43±8.24)U/L(P<0.05)。结论 在一定条件下，UCP2基因-866G/A,Ins/Del多态性可能影响宁夏地区回族人群血清GSH值。

解偶联蛋白2； 基因多态性； 回族人群； 抗氧化物质

脑缺血是常见多基因疾病，严重影响着人们的生活质量[1]。宁夏地区回族人群中，脑缺血发病率在逐年升高。寻找到与回族脑缺血人群中具有临床治疗意义的功能性基因，将为在宁夏地区回族人群中开展脑缺血的防治工作提供有力的帮助。

解偶联蛋白2(uncouple protein 2)参与调控细胞线粒体功能，为机体能量代谢的功能性基因[2]。本课题组在研究中发现，UCP2参与脑缺血的发病过程[3]。大量研究证明，在不同人群中UCP2存在多位点的基因多态性[4]。基因的单核苷酸多态性(SNPs)是形成个体间差异的重要遗传学基础[5]。功能性的SNP可能影响基因的表达水平及蛋白的活性，进而影响其在机体细胞内的功能[6]。机体内抗氧化物质对脑缺血患者的预后有重要的意义，UCP2基因多态性是否影响体内抗氧化物质的含量，目前尚未见到相关研究。

本研究首次以宁夏地区回族健康人群及脑缺血患者为研究对象，选择血清过氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、血清总抗氧化能力(total antioxidant capacity,TAOC)及谷胱甘肽(glutathione,GSH)为体内抗氧化物质代表，分析UCP2基因多态性是否影响回族人群体内抗氧化物质水平。

1 材料与方法

1.1 研究对象 回族脑缺血患者诊断及正常对照组：脑缺血组71例，来自2014年1月-2015年10月在宁医大总院就诊的宁夏地区回族住院患者，年龄50～65岁，均行头部CT和/或MRI检查，证实脑缺血，诊断依据中华医学会神经病学分会脑血管病学组急性缺血性脑卒中诊治指南。对照组97例，为同期门诊查体宁夏回族健康者,年龄50～65岁。所有研究对象均行生化项目检查并签署知情同意书。

1.2 材料与方法

1.2.1 样本基因组DNA提取 采集外周血经抗凝后，采用QIANGEN minikit按试剂盒说明书进行基因组DNA提取，利用Nanodrop ND1000测定DNA浓度，用琼脂糖凝胶电泳判断DNA质量，筛选优质DNA做后续实验。

1.2.2 聚合酶链反应-限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)技术 采用Oligo7.0软件设计引物。各位点引物序列为：UCP2-866G/A，上游引物 5’-CACGCTGCTTCTGCCAGG AC-3’；下游引物 5’-AGGCGTCAGGAGATGGACCG-3’。Ala55Val(Exon4)，上游引物 5’-CTCCTCTTGGCTTAGATTCCTG-3’；下游引物 5’-GACAGAATCATACAGGCCGAT-3’。Ins/Del (Exon8)，上游引物 5’-TGCCCTCCTTTCTCCGCTTG-3’；下游引物 5’-ATGGACCAGATGACCTACACG-3’。采用常规PCR扩增包含相应位点的DNA片段。经凝胶电鉴定扩增产物后，经限制性内切酶消化，37 ℃ 4 h。酶切产物电泳后，采用Bio-Rad凝胶成像系统判断基因分型。图1为UCP2Ins/Del基因型Ins/Ins、Ins/Del及Del/Del PCR产物琼脂糖电泳代表性结果，泳道1为位于470 bp的基因型Ins/Ins，泳道3为420 bp的基因型Del/Del，泳道2为杂合子Ins/Del(见图1)。

1.2.3 血清中抗氧化物检测 分别采用试剂盒检测血清中SOD、TAOC及GSH,所有操作程序均按试剂盒说明书进行。

2 结 果

2.1 样本临床基本资料统计结果 将收集的正常对照组与脑缺血组临床基本资料比较，结果显示：正常对照组性别(男/女)比例为47/50，脑缺血组性别比例为37/34；正常对照组年龄组成为57.55±3.66，脑缺血组年龄组成为58.68±3.86；正常对照组体重为64.15 kg±8.63 kg，脑缺血组体重为65.58 kg±8.25 kg；两组在性别比例、年龄组成及体重等基础数据方面无统计学差异(P>0.05)；脑缺血组血清甘油三酯含量为(1.62±0.58)mmol/L高于正常对照组(1.62±0.58)mmol/L(P<0.05)，两组样本血清总胆固醇测量值无统计学差异(P>0.05)(见表1)。

2.2 宁夏地区回族健康人群及脑缺血患者血清抗氧化物质检测结果比较 宁夏地区回族健康人群及脑缺血患者血清抗氧化物质检测发现：脑缺血患者血清SOD值为(63.39±6.96)U/ml，明显低于回族健康人群检测值(74.89±11.17)U/ml(P<0.05)；脑缺血患者血清TAOC值为(14.18±2.95)U/ml，明显低于回族健康人群检测值(20.03±3.98)U/ml(P<0.05)；脑缺血患者血清GSH值为(113.59±8.24)U/L，低于回族健康人群检测值(127.14±7.21)U/L(P<0.05)(见表2)。

2.3 宁夏地区回族健康人群及脑缺血患者UCP2基因-866G/A、Ala55Val及Ins/Del不同基因型血清SOD值检测结果比较 比较回族健康者及脑缺血患者两组间及各组内UCP2各突变位点不同基因型血清SOD值，结果显示：同一基因型脑缺血组SOD值均低于正常对照组(P<0.05)；但脑缺血组及正常对照组同组内UCP2各突变位点不同基因型人群血清SOD值无统计学差异(P>0.05)(见表3)。

2.4 宁夏地区回族健康人群及脑缺血患者UCP22基因-866G/A、Ala55Val及Ins/Del不同基因型血清TAOC值检测结果比较 比较回族健康者及脑缺血患者两组间及各组内UCP2各突变位点不同基因型血清TAOC值，结果显示：同一基因型脑缺血组TAOC值均低于正常对照组(P<0.05)；但脑缺血组及正常对照组同组内UCP2各突变位点不同基因型人群血清TAOC值无统计学差异(P>0.05)(见表4)。

2.5 宁夏地区回族健康人群及脑缺血患者UCP2基因-866G/A、Ala55Val及Ins/Del不同基因型血清GSH值检测结果比较 比较回族健康者及脑缺血患者两组间及各组内UCP2各突变位点不同基因型血清GSH值，结果显示：同一基因型脑缺血组GSH值均低于正常对照组(P<0.05)；正常健康人群中，GA基因型血清GSH值(125.78±4.55)U/L低于GG野生型基因型GSH值(130.35±10.68)U/L(P<0.05)；脑缺血组Ins/Ins基因型血清GSH值(108.71±8.30)U/L低于Del/Del基因型血清GSH值(116.43±8.24)U/L(P<0.05)；脑缺血组及正常对照组同组内UCP2其它突变位点不同基因型人群血清SOD值无统计学差异(P>0.05)(见表5)。

表1 脑缺血组及正常对照组基本资料比较

与正常组相比*P<0.05

表2 脑缺血组及正常对照组血清抗氧化物质检测结果比较

与正常组相比*P<0.05

表3 UCP2各突变位点不同基因型脑缺血组及正常对照组血清SOD值

与正常组相比*P<0.05

表4 UCP2各突变位点不同基因型脑缺血组及正常对照组血清TAOC值

与正常组相比*P<0.05

表5 UCP2各突变位点不同基因型脑缺血组及正常对照组血清GSH值

与正常组GG基因型相比△P<0.05；与缺血组Del/Del基因型相比#P<0.05；与正常组相比*P<0.05

M：Marker 1:Ins/Ins；2:Ins/Del；3:Del/Del

3 讨 论

人类的基因组序列存在个体差异，包括对疾病的易感性、对同一疾病治疗药物的反应性等。基因的单核苷酸多态性(SNPs)是形成个体间差异的重要遗传学基础[5]。宁夏回族人群因其宗教信仰及居住地理位置等因素具有相对稳定的基因遗传特点，是多种基因疾病谱分析的宝贵人类资源[7]。

脑缺血的发病机制较为复杂。脑缺血的发病与机体细胞能量代谢水平紊乱相关，脑缺血发生后，体内产生的大量过氧化物若不及时清除，将导致神经细胞对脑缺血的易感性升高，对机体造成严重的损害[8]。体内各种抗氧化物参与机体清除多余过氧化物质，为重要的机体保护物质之一。体内抗氧化物水平的高低决定在应激状态下机体能否有效地清除多余过氧化物。本研究结果证实，脑缺血后，体内抗氧化物水平明显降低。这与脑缺血后，体内产生大量的过氧化物消耗了抗氧化物有关。

UCP2基因参与调控细胞线粒体功能，为维持机体稳态的功能性基因[2]。已有研究证明，UCP2基因参与脑缺血的发病过程[9]。有研究者证实，UCP2通过参与神经元线粒体氧化磷酸化过程降低神经元过氧化物水平[10]。本课题组在以往研究中发现，UCP2功能缺陷能够影响体内抗氧化物GSH水平，但其具体机制仍未阐明[3]。

大量研究证明，UCP2具有基因多态性。功能性的SNP可能影响基因的表达水平及蛋白的活性，进而影响其在机体细胞内的功能[11]。UCP2-866G/A、UCP2 Ala55Val和UCP2 Ins/Del被证明在一些特定人群与糖尿病的发病风险密切相关[12]。还有研究证明，以上3个位点的多态性影响UCP2基因表达水平及蛋白功能，影响细胞的能量代谢[13]。本研究发现，在宁夏地区回族健康人群中，UCP2基因-866位点GA基因型血清GSH值低于GG野生型基因型GSH值；脑缺血患者中Ins/Del位点组Ins/Ins基因型血清GSH值低于Del/Del基因型血清GSH值。这可能与基因位点突变后导致UCP2基因功能不稳定相关。

本研究首次以宁夏地区回族人群为研究对象，分析UCP2基因多态性对血清抗氧化物质含量的影响。为临床脑缺血的治疗及预后判断提供了理论依据。

[1]Rodriguez C,Sobrino T,Agulla J,et al.Neovascularization and functional recovery after intracerebral hemorrhage is conditioned by the Tp53 Arg72Pro single nucleotide polymorphism[J].Cell Death Differ,2017,24(1):144-154.

[2]Lopez NE,Gaston L,Lopez KR,et al.Early ghrelin treatment attenuates disruption of the blood brain barrier and apoptosis after traumatic brain injury through a UCP-2 mechanism[J].Brain Res,2012,13(1489):140-148.

[3]Liang X,Nagai A,Sheikh AM,et al.Increased vulnerability of hippocampal CA1neurons to hypoperfusion in ataxia and male sterility (AMS) mouse[J].Brain Res,2013,1494:109-117.

[4]Nicoletti CF,Kimura BM,de Oliveira BA,et al.Role of UCP2 polymorphisms on dietary intake of obese patients who underwent bariatric surgery[J].Clin Obes,2016,6(5):354-358.

[5]Ogura Y,Kou I,Miura S,et al.A functional SNP in BNC2 is associated with adolescent idiopathic scoliosis[J].The American Journal of Human Genetics,2015,97(2):337-342.

[6]Yao L,Tak YG,Berman BP,et al.Functional annotation of colon cancer risk SNPs[J].Nat Commun,2014,5(5114):1-13.

[7]杨静文,杨 婷,王冠华,等.宁夏回、汉族食管癌手术患者临床生物学特征及预后对比[J].世界华人消化杂志,2016,24(20):3171-3176.

[8]Atik I,Kozac IN,Beydilli I,et al.Investigation of oxidant and antioxidant levels in patients with acute stroke in the emergency service[J].Am J Emerg Med,2016,8:30.

[9]Hass DT,Barnstable CJ.Uncoupling protein 2 in the glial response to stress:implications for neuroprotection[J].Neural Regen Res,2016,11(8):1197-1200.

[10]Negre-salvayre A,Hirtz C,Carrera G,et al.A role for uncoupling protein2 as a regulator of mitochondrial hydrogen peroxide generateon[J].FASEB J,1997,11(10):809-815.

[11]Zhou Y,Simmons D,Hambly BD,et al.Interactions between UCP2 SNPs and telomere length exist in the absence of diabetes or pre-diabetes[J].Sci Rep,2016,6(33147):1-7.

[12]de Souza BM,Brondani LA,Boucas AP,et al.Associations between UCP1-3826A/G,UCP2-866G/A,Ala55Val and Ins/Del,and UCP3-55C/T polymorphisms and susceptibility to type 2 diabetes mellitus:case-control study and meta-analysis[J].PLoS One,2013,8(1):e54259:1-11.

[13]Manche SK,Jangala M,Putta P,et al.Association of oxidative stress gene polymorphisms with presbycusis[J].Gene,2016,593(2):277-283.

Effects of single nucleotide polymorphism of UCP2-866G/A,Ala55Val,Ins/Del on serum antioxidant level in Ningxia Hui Population

LIANG Xueyun，YAO Ziang,MA Binwu,et al.

(Ningxia Human Stem Cell Research Institution,General Hospital of Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,China)

Objective To explore the effects of single nucleotide polymorphism of Uncouple protein 2 (UCP2)-866G/A,Ala55Val,Ins/Del on serum antioxidant level in Ningxia Hui population.Methods After extracted genomic DNA from the collected peripheral blood,the single nucleotide polymorphisms of UCP2-866G/A,Ala55Val,Ins/Del were tested by PCR-RELF method.The levels of serum antioxidant were measured by kit.Results In normal group,the serum GSH level was lower in UCP2-866 GA genotype than that in UCP2-866 GG genotype.In stroke group,the serum GSH level was lower in UCP2 Ins/Ins genotype than that in UCP2 Del/Del genotype.Conclusion The single nucleotide polymorphisms of UCP2-866G/A and UCP2Ins/Del may have effects on the serum GSH level in Ningxia Hui population in different conditions.

Uncouple protein 2; Single nucleotide polymorphism; Hui population; Antioxidants

2017-04-01；

2017-05-30

国家自然科学基金项目(81460197)；国家自然科学基金项目(81460186)；宁夏自然科学基金项目(NZ14130)；宁夏高等学校科研项目(NGY2013055)

(1.宁夏医科大学总医院宁夏人类干细胞研究所，宁夏 银川 750004；2.宁夏医科大学2015级研究生，宁夏 银川 750004；3.宁夏医科大学总医院神经内科，宁夏 银川 750004；4.宁夏医科大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系，宁夏 银川 750004；5.宁夏颅脑疾病重点实验室，宁夏 银川 750004)

何仲义，E-mail:hzy-008@163.com

1003-2754(2017)08-0703-04

R743.3

A