双硒交联智能纳米胶束的制备及其药物释放研究

周 原，王金梅，张 寒

(武汉工程大学化工与制药学院，湖北 武汉 430074)

双硒交联智能纳米胶束的制备及其药物释放研究

周 原，王金梅，张 寒*

(武汉工程大学化工与制药学院，湖北 武汉 430074)

以含有羟基的葡聚糖(Dex)和含有羧基的硒辛酸(SA)通过酯化反应得到两亲性聚合物Dex-SA，然后在水中自组装形成具有还原响应性的交联Dex-SA纳米胶束。该纳米胶束呈圆球形，平均粒径为(161±10) nm，多分散指数为0.13，Zeta电位为(-20.3±1.4) mV，负载阿霉素(DOX)后的载药率和包封率分别为10.4%和58.9%。药物释放实验表明，交联Dex-SA载药纳米胶束在pH值7.4的10 mmol·L-1PBS溶液中的12 h累计释放率为20.4%，添加10 mmol·L-1还原型谷胱甘肽(GSH)后的12 h累计释放率可达85.2%。细胞毒性实验表明，交联Dex-SA载药纳米胶束不仅保留了DOX原药本身的高细胞毒性，而且减少了对正常细胞的损伤。交联Dex-SA纳米胶束作为药物载体具有潜在的应用价值。

双硒交联；智能纳米胶束；自组装；还原响应性；药物释放；细胞毒性

由两亲性聚合物在水中通过自组装形成的纳米胶束可以作为疏水性抗癌药物的理想载体。相比其它药物载体，纳米胶束具有低毒、生物相容性好等优点[1-2]，同时能够利用肿瘤部位的高通透性和滞留效应(EPR)将纳米胶束被动靶向肿瘤细胞，实现在肿瘤部位的有效聚集，提高药物利用度[3]，但是无法在细胞内完成快速释放。

双硒键在低浓度还原性物质的作用下会发生断裂，引起载体结构的变化从而释放药物。这些还原性物质主要是还原型谷胱甘肽(GSH)，细胞内GSH浓度(2～10mmol·L-1)远高于细胞外GSH(2μmol·L-1)，癌细胞内GSH浓度更高[4]，因此，可以利用双硒键作为刺激因子释放药物。双硒键键能(172kJ·mol-1)低于双硫键(240kJ·mol-1)，因此含有双硒键的药物载体具有更灵敏的还原响应性。此外，双硒键还具有抗氧化[5]和催化[6]的功能，可用来清除人体内的代谢废物。葡聚糖是天然多糖，具有来源广泛、水溶性好、生物相容性好、降解产物为内源性[7-8]等特点，对其进行疏水性修饰后可自组装形成胶束，实现对难溶性抗肿瘤药物的有效包裹。

作者在此以含有羟基的葡聚糖(Dex)和含有羧基的硒辛酸(SA)通过酯化反应得到两亲性聚合物Dex-SA，然后在水中自组装形成具有还原响应性的交联Dex-SA纳米胶束，并将其用于负载阿霉素(DOX)进行药物释放研究和细胞毒性实验。

1 实验

1.1 试剂与仪器

葡聚糖(Dex，MW=20 kDa)、二环乙基碳酰亚胺(DCC，99%)、二甲氨基吡啶(DMAP，99%)、还原型谷胱甘肽(GSH，99%)、1，4-二硫代苏糖醇(DTT，99%)，上海阿拉丁有限公司；阿霉素盐酸盐(DOX·HCl)，大连美仑生物技术有限公司；二甲基亚砜(DMSO)、二氯甲烷(DCM)、三乙胺(TEA)，分析纯，国药集团上海化学试剂有限公司。

SpectraMax M2e型多功能酶标仪，美国分子仪器有限公司；7420070型冷冻干燥机，美国Labconco公司；JEN3690型激光粒度仪，英国马尔文公司；TecnaiG2S型透射电镜，荷兰飞利浦公司；F-4600型荧光分光光度计，日本日立仪器公司；Mercury VX-300型核磁共振波谱仪，美国Varian技术公司。

1.2 葡聚糖-硒辛酸(Dex-SA)的合成

参照文献[9]合成得到SA 10.10 g，产率67%。

将SA(0.30 g，1.00 mmol)溶解于10 mL DCM中，移至50 mL单口烧瓶中。将溶解在5 mL DCM中的DCC(0.30 g，1.46 mmol)也加到单口烧瓶中。在氮气保护下搅拌反应20 h，维持温度在30 ℃。过滤，旋蒸除去溶剂，真空干燥得到硒辛酸酸酐。取Dex(0.34 g，2.00 mmol)于50 mL单口烧瓶中，并用8 mL DMSO溶解；同时将DMAP(0.20 g，1.60 mmol)、硒辛酸酸酐(0.78 g，1.60 mmol)分别溶解在2 mL DMSO中，也加入到单口烧瓶中。在氮气保护下于30 ℃搅拌反应48 h。加入大量冰乙醇搅拌，将得到的沉淀过滤，洗涤3次，真空干燥48 h，即得到两亲性聚合物Dex-SA。取代度60%，产率71%。

1.3 交联Dex-SA纳米胶束的制备

采用透析法制备交联Dex-SA纳米胶束：首先将20.0 mg Dex-SA完全溶解于10 mL DMSO后移至100 mL烧瓶中，在25 ℃磁力搅拌下将50 mL超纯水用注射泵滴加到上述溶液中，放入透析袋(截留分子量7 000)中用pH值7.4的10 mmol·L-1磷酸盐缓冲溶液(PBS)透析(透析袋外溶液至少更换5次)，24 h后取出，得到Dex-SA纳米胶束。然后将Dex-SA纳米胶束溶液用0.7 mol·L-1硼酸盐缓冲溶液调pH值至8.5，通氮气15 min，加入DTT进行交联，交联剂DTT用量为Dex-SA纳米胶束中双硒键摩尔数的10%，在氮气保护下于25 ℃搅拌反应22 h后放入透析袋中，用10 mmol·L-1PBS透析24 h，除去未反应的DTT，即得到交联Dex-SA纳米胶束。

1.4 交联Dex-SA载药纳米胶束的制备

DOX·HCl的脱盐处理：精确称取30.0 mg(0.05 mmol)DOX·HCl溶于6 mL DMSO中，滴加24 μL(0.16 mmol)TEA，搅拌一晚上，吸走上层清液，得到5 mg·mL-1DOX溶液。

交联Dex-SA载药纳米胶束的制备：先将0.8 mL DOX溶液与Dex-SA溶液混合，再按1.3方法加入超纯水制备交联Dex-SA载药纳米胶束(以下简称载药胶束)。

冷冻干燥除去载药胶束溶液中的水，加入一定量的DMSO溶解，取50 μL，再加入4 mL DMSO，用连续光谱光密度仪测定其荧光值，依据DOX标准曲线计算载药率和包封率。

1.5 载药胶束的药物释放实验

采用2组实验进行药物释放对比研究，每组做3个平行：第一组实验环境液为pH值7.4的10 mmol·L-1PBS；第二组实验环境液为pH值7.4的10 mmol·L-1PBS+10 mmol·L-1GSH。取5 mL载药胶束溶液于透析袋中，分别置于装有20 mL环境液的离心管中。将离心管置于恒温(37.4 ℃)水浴振荡器中振荡一定时间后，取3 mL环境液作为测定液，同时补加同体积的新鲜环境液。用连续光谱光密度仪测定测定液中DOX的荧光强度，依据DOX标准曲线，计算DOX的释放量。

1.6 载药胶束的细胞毒性实验

分别以人类宫颈癌细胞(HeLa)、人类肝癌细胞(HepG2)和人类正常肝细胞(L02)为受试细胞，采用MTT法对载药胶束的细胞毒性进行测试。

以HeLa细胞为例，将其以每孔5 000～6 000个细胞的密度，用100 μL含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基接种于96孔板中，在37 ℃、5%CO2条件下用培养箱培养24 h。待细胞贴壁生长后，分别将100 μL用培养基稀释好的不同浓度的载药胶束和不同浓度的DOX溶液加入96孔板中，空白对照为100 μL含10% FBS的RPMI-1640培养基，培养48 h。然后将所有孔中的液体吸出，每孔加入100 μL培养基和20 μL MTT溶液(5 mg·mL-1)，培养4 h。最后将孔中的液体再次取出，每孔加入150 μL DMSO，待析出的甲臜晶体全部溶解后用酶标仪于570 nm处测定吸光度(A)，计算细胞存活率。

2 结果与讨论

2.1 Dex-SA的表征

2.1.1 核磁共振氢谱分析(图1)

图1 Dex和Dex-SA的核磁共振氢谱

从图1可以看出，SA被成功修饰到Dex侧链上。取代度(每100个糖单元上修饰的SA的数目)可以通过Dex中b(4.78 ppm)与SA五元环上次甲基特征峰j(1.86～1.92 ppm)的峰面积之比求得，本实验所制备的Dex-SA的取代度为60%。

2.1.2 拉曼光谱分析(图2)

图2 SA、Dex和Dex-SA的拉曼光谱

从图2可以看出，Dex-SA在296 cm-1处有一明显单峰，与双硒键特征峰(290～330 cm-1)正好吻合，再次证明了SA被成功修饰到Dex的侧链上。

2.2 交联Dex-SA纳米胶束的表征

2.2.1 粒径分布

通过动态光散射(DLS)对交联Dex-SA纳米胶束的粒径进行表征，结果如图3所示。

图3 交联Dex-SA纳米胶束的粒径分布

从图3可以看出，交联Dex-SA纳米胶束的平均粒径为(161±10) nm，并且具有相当低的多分散指数(PDI=0.13)，这对于药物载体来说是非常理想的尺寸。与未交联Dex-SA纳米胶束相比，粒径约减小20 nm，这表明交联使得Dex-SA纳米胶束结构更加紧密，从而能够提高Dex-SA纳米胶束的稳定性。

2.2.2 透射电镜分析(图4)

图4 交联Dex-SA纳米胶束的TEM照片

从图4可以看出，交联Dex-SA纳米胶束大小均一，呈圆球形，粒径为130 nm左右，比DLS测出的数据要小30～40 nm，可能是因为进行透射电镜分析制样时，失去水分造成粒径变小。

Zeta电位分析表明，交联Dex-SA纳米胶束由于亲水端的Dex提供了大量的负电荷和足够的亲水性，使得表面带负电荷，Zeta电位为(-20.3±1.4) mV，保证了胶束在运输时不会被带负电荷的蛋白吸附和网状内皮系统(RES)吞噬。

2.2.3 紫外光谱分析(图5)

图5 Dex-SA纳米胶束的紫外光谱

从图5可以看出，Dex-SA纳米胶束在332 nm处有一个特征吸收峰，正好是侧链SA五元环的特征吸收峰；而交联Dex-SA纳米胶束由于在DTT的作用下五元环开环，所以这个特征峰消失。表明DTT可以成功地使Dex-SA纳米胶束通过双硒键进行交联。

2.2.4 稳定性分析

临界胶束浓度(CMC)测试结果表明，交联Dex-SA纳米胶束具有极低的CMC值(10.7 mg·L-1)，这极大地保证了胶束的稳定性，即使注射后被血液稀释，也不会出现结构被破坏的情况。

通过加入高浓度(最高2 mol·L-1)的氯化钠溶液或高度稀释(1 000倍)的方法来研究交联Dex-SA纳米胶束的盐稳定性，结果如图6所示。

图6 Dex-SA纳米胶束的盐稳定性

从图6可以看出，交联Dex-SA纳米胶束在0.2 mol·L-1氯化钠溶液中，粒径基本保持不变，在2 mol·L-1氯化钠溶液中也保持很好的稳定性，粒径从130 nm左右增大到200 nm左右，但分布变化很小；而未交联Dex-SA纳米胶束在0.2 mol·L-1氯化钠溶液中粒径就已经发生了很大变化，增大到800 nm以上。这主要是因为，交联Dex-SA纳米胶束的结构因为交联而被加固，所以十分稳定，即使在高盐、高度稀释的情况下，这种结构也能非常稳定地存在；而未交联Dex-SA纳米胶束是通过自组装形成的，胶束主要靠分子间的相互作用力维系，在高度稀释和高盐的情况下，分子间作用力被严重破坏，纳米胶束发生了解离，导致部分团聚使得粒径变大。

交联Dex-SA纳米胶束在pH值7.4的PBS溶液中放置0 d、2 d、8 d、15 d时的粒径变化如图7所示。

图7 交联Dex-SA纳米胶束的粒径稳定性

从图7可以看出，交联Dex-SA纳米胶束在pH值7.4的PBS溶液中放置8 d，粒径保持在175～210 nm，PDI基本无变化；15 d后粒径增大到500 nm左右，分布变宽。表明交联Dex-SA纳米胶束具有较好的稳定性。

2.3 药物释放研究

在pH值为7.4的条件下，通过控制环境中GSH浓度，分析载药胶束在药物累计释放过程中的还原敏感性能。载药胶束的药物释放曲线如图8所示。

图8 载药胶束的药物释放曲线

从图8可以看出，在无GSH的环境中，药物释放缓慢，12 h累计释放率只有20.4%，34 h最终释放率仅22.5%；而当环境中加入少量的还原剂GSH后，2 h即可实现约47.1%的累计释放率，释放效率显著提高。这是由于在GSH环境中，载药胶束的双硒键被部分打断生成硒醇，胶束逐渐解体，药物快速释放，34 h最终释放率高达90.6%。可见，即使在低浓度还原剂环境中，双硒键依然有灵敏的响应性，能够实现药物的快速释放。计算得到包封率为58.9%，载药率为10.4%。

对载药胶束在10 mmol·L-1GSH中的药物释放数据进行拟合，根据拟合度(R2)来判定曲线拟合情况，结果见图9。

a.零级动力学方程 b.一级动力学方程 c.Higuchi方程 d.双相动力学方程

从图9可以看出，载药胶束的药物释放行为用零级动力学方程、一级动力学方程以及Higuchi方程描述时，拟合度R2均不是很理想，而双相动力学方程的拟合度较好，达到0.996。载药胶束在2 h内有突释行为，释药速率快，2 h累计释放率达到48%，可能是因为载药胶束表面吸附有少量DOX以及分子扩散作用所致。之后再逐渐解体释放剩余的DOX。基于此研制的抗癌药物可以在载药胶束到达病灶部位后迅速释放出较多药物，达到较高浓度，然后缓慢释放出剩余药物，维持一定的药效。

2.4 细胞毒性研究

载药胶束和DOX对HeLa细胞、HepG2细胞、L02细胞的细胞毒性如图10所示。

图10 载药胶束和DOX对HeLa(a)、HepG2(b)和L02细胞(c)的细胞毒性

从图10可以看出，载药胶束对HeLa和HepG2细胞的IC50值分别为3.21 μg·mL-1和1.97 μg·mL-1，DOX对HeLa和HepG2细胞的IC50值分别为4.29 μg·mL-1和3.00 μg·mL-1，表明载药胶束可以有效抑制HeLa和HepG2细胞的生长；载药胶束对正常细胞L02的毒性明显降低，在相同剂量(DOX浓度4.97 μg·mL-1)下，DOX对L02细胞的相对存活率是50%，而载药胶束对L02细胞的相对存活率达70%，表明载药胶束可有效降低药物对正常细胞的毒副作用。

为更进一步验证载药胶束对3种细胞的细胞毒性，进行了对比实验，考察未载药交联Dex-SA纳米胶束对3种细胞的细胞毒性，结果见图11。

图11 未载药交联Dex-SA纳米胶束对HeLa、HepG2和L02细胞的细胞毒性

从图11可以看出，未载药交联Dex-SA纳米胶束在浓度高达40 μg·mL-1时，对3种细胞的生长都没有抑制作用，细胞相对存活率均高于100%。进一步表明载药胶束能够有效抑制HeLa、HepG2、L02细胞的生长，且交联Dex-SA纳米胶束无毒性。

3 结论

制备了具有载药性能的双硒交联的还原响应性纳米胶束Dex-SA，该纳米胶束呈圆球形，平均粒径为(161±10) nm，多分散指数为0.13，Zeta电位为(-20.3±1.4) mV。交联Dex-SA纳米胶束在2 mol·L-1氯化钠溶液中稳定性良好。将其负载DOX后的载药率和包封率分别为10.4%和58.9%，在pH值为7.4的10 mmol·L-1PBS溶液中的12 h累计释放率为20.4%，在10 mmol·L-1GSH存在下，12 h累计释放率可达到85.2%。交联Dex-SA纳米胶束本身无毒性；而载药胶束不仅保留了DOX原药本身的高细胞毒性，而且减少了对正常细胞的损伤，呈现出良好的剂量依赖性。交联Dex-SA纳米胶束具有促进DOX在肿瘤位点的累积释放和提高药物载药性能的优势，是一种良好有效的化疗方法，在肿瘤治疗中有着广阔的应用前景。

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Preparation and Drug-Release Behavior of Diselenide-Crosslinked Smart Nanomicelle

ZHOU Yuan,WANG Jin-mei,ZHANG Han*

(SchoolofChemicalEngineeringandPharmacy,WuhanInstituteofTechnology,Wuhan430074,China)

Throughesterificationofhydroxyl-containingdextran(Dex)andcarboxyl-containingselenooctanoicacid(SA),wesynthesizedtheamphiphilicpolymerDex-SA,whichself-assembledtoformcrosslinkedDex-SAnanomicellewithreductionresponsivenessinaqueoussolution.Thenanomicellehadasphericalshapewithaverageparticlesizeof(161±10)nm,polydispersityindexof0.13,andZetapotentialof(-20.3±1.4)mV.Whendoxorubicin(DOX)wasloadedonthenanomicelle,thedrug-loadingratioandentrapmentefficiencywere10.4%and58.9%,respectively.Drug-releaseexperimentshowedthattheaccumulativereleaserateofDOX-loadednanomicellewas20.4%after12hin10mmol·L-1PBS(pHvalue7.4),whichreached85.2%afteradding10mmol·L-1glutathione.CytotoxicityexperimentshowedthatDOX-loadednanomicellenotonlyretainedthehighcytotoxicityofDOX,butalsoreducedthedamagetonormalcells.Therefore,asadrugcarrier,thecrosslinkedDex-SAnanomicellehasapotentialapplicationvalue.

diselenide-crosslinked;smartnanomicelle;self-assembly;reductionresponsiveness;drug-release;cytotoxicity

2017-04-05

周原(1992-)，女，湖北枝江人，硕士研究生，研究方向：生物医用功能高分子材料，E-mail:1149356540@qq.com；通讯作者：张寒，实验员，E-mail:zhanghan891208@126.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.08.011

O648

A

1672-5425(2017)08-0053-06

周原，王金梅，张寒.双硒交联智能纳米胶束的制备及其药物释放研究[J].化学与生物工程，2017，34(8)：53-58.