子痫前期患者胎盘组织p-p38与caspase-3、8的表达及临床意义

徐 佳，刘朵朵，马向东，陈必良

(第四军医大学西京医院妇产科，陕西 西安 710032)

子痫前期患者胎盘组织p-p38与caspase-3、8的表达及临床意义

徐 佳，刘朵朵，马向东，陈必良

(第四军医大学西京医院妇产科，陕西 西安 710032)

目的 研究p-p38、caspase-3、caspase-8在子痫前期患者胎盘中的表达及临床意义。方法 选择2016年 6月至2017年 2月在西京医院妇产科住院分娩的孕妇80例，分为子痫前期组40例，正常妊娠组40例，采用免疫组化法及蛋白印迹法检测子痫前期患者和正常妊娠妇女胎盘滋养细胞中p-p38、caspase-3、caspase-8的表达。结果 p-p38、caspase3、caspase8在子痫前期胎盘和正常妊娠胎盘中均有表达；在子痫前期患者胎盘中p-p38、caspase-3、caspase-8表达与正常胎盘相比显著升高(2.08±0.04vs 1.44±0.04、1.72±0.03 vs 1.12±0.06、1.59±0.04 vs 1.18±0.01，t值分别为71、60、61，均P<0.01)。结论 胎盘组织中p-p38、caspase-3、caspase-8的异常表达可能促进滋养细胞凋亡增加，推进子痫前期的发生发展。

p-p38;caspase-3;caspase-8；子痫前期；滋养细胞

子痫前期(preeclampsia,PE)是产科常见的严重并发症，是孕产妇和围产儿病死率升高的主要原因[1]。研究表明子痫前期胎盘中滋养细胞凋亡过多，导致其浸润功能下降、浸润过浅即胎盘浅着床，最终引起胎盘灌注不足、缺血缺氧，因此子痫前期的发生及进展与滋养细胞凋亡密切相关，但调控滋养细胞凋亡的机制尚不清楚[2]。研究发现，p38MAPK通过多种途径在炎症反应和细胞凋亡中发挥重要作用，凋亡蛋白caspase-3、caspase-8是细胞凋亡过程中的关键蛋白酶，均参与细胞凋亡凋控[3]。本研究探讨子痫前期患者胎盘组织中p-p38及凋亡蛋白caspase-3、caspase-8的表达，为子痫前期的发病机制提供依据。

1资料与方法

1.1一般资料

选择2016年6月至2017年2月第四军医大学西京医院妇产科行剖宫产的子痫前期患者40例，平均孕周为(33.4±3.1)周，平均年龄为(26.8±3.8)岁；选择同期行择期剖宫产的正常足月单胎妊娠孕妇40例为对照，平均孕周为(39.1±0.7)周，平均年龄(27.6±3.2)岁。子痫前期诊断标准参照谢幸主编的第8版《妇产科学》。两组孕妇排除标准：多胎妊娠、原发性高血压、妊娠期糖尿病、肝肾疾病、感染、妊娠合并免疫系统疾病史等。

1.2方法

1.2.1标本收集及处理

全部组织标本均在剖宫产手术中收集，待胎盘娩出后，立即从胎盘母体面中央处取材，取胎盘组织约1cm×1cm×1cm大小,快速在冷生理盐水中清洗3次，放入EP管中，置于液氮罐内；另取0.5cm×0.5cm组织，以PBS缓冲液清洗3次后放入10%中性福尔马林液固定，按常规制备成石蜡块，4℃冰箱保存。整个操作过程的时间在15min以内完成。

1.2.2免疫组化检测胎盘组织中p-p38、caspase-3、caspase-8的定位表达

采用免疫组化SP法。p-p38、caspase-3、caspase-8免疫组化试剂盒、DAB染色试剂盒由北京中山生物技术有限公司提供。胎盘组织固定8h后常规逐级脱水，二甲苯透明，浸蜡过夜，包埋后制成6μm切片。石蜡切片经常规脱蜡、水合，于枸橼酸盐(EDTA)缓冲液中进行抗原修复，用1%H2O2、0.5%牛血清蛋白(BSA)处理后，加入兔抗人ADAMI9抗体(1：200)，4℃孵育过夜后，滴加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，室温孵育30min，DBA(二氨基联苯胺四盐酸)显色，苏木素复染，常规脱水封片。阳性结果判断标准：标本组织细胞中有(棕)黄色颗粒沉着。根据棕色反应的阳性面积比判断结果。

1.2.3Western blot法检测胎盘组织中p-p38 及caspase-3、caspase-8

取胎盘组织 100mg置入裂解液中,冰浴匀浆,裂解液含 5%N P-40,10mmol/L Tris HCl pH7.4,150mmol/LNaCl,1mmol/L EDTA,1mmol/L Na3VO4pH10.0,1μg/mL aprotinin,100μg/mL PMSF。用Bradford 法检测蛋白浓度。配制10%聚丙烯酰胺凝胶，上样量每孔30μg，浓缩胶电泳电压100V，分离胶电泳电压120V。半干转蛋白至PVDF膜上，70mA ,35min。TBS T洗脱2次，每次10min，10%脱脂奶粉室温封闭 3h ,加入 2.5%BSA稀释的p-p38以及caspase-3、caspase-8、兔抗人多克隆抗体(1：400),4 ℃孵育过夜 , TBST 漂洗3 次每次10min后 ,加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗IgG(1：3 000),37孵育1h ,TBST洗3次，每次10min。 按照ECL检测试剂盒(Pierce公司)说明进行显色、曝光、X光片冲洗，将X光片透视扫描后，印迹的灰度值经Gel-Pro Analyzer软件分析 (United Bio公司)，并以actin的灰度值作为内参进行结果的均一。

1.3统计学方法

采用SPSS17．0软件进行统计学分析。p-p38、caspase-3、caspase-8表达水平组间比较，用ANOVA方差分析和t检验,以P<0.05作为差异有统计学意义的检验标准。

2 结果

2.1两组孕妇胎盘中p-p38、caspase-3、caspase-8的免疫组化染色

镜下，p-p38和caspase-3、caspase-8在子痫前期组细胞滋养细胞中可见大量棕黄色颗粒的阳性表达，而正常妊娠组内仅可见少量阳性表达。通过免疫组化染色发现，p-p38、caspase-3、caspase-8定位于胎盘组织中细胞滋养细胞，在绒毛间质细胞中也可见少量表达，阳性定位在细胞浆，见图1。采用Mias图象分析系统对其进行定量分析,在子痫前期组和对照组之间，p-p38、caspase-3、caspase-8的表达有统计学意义(0.08±0.01 vs 0.02±0.004，0.07±0.01 vs 0.01±0.002，0.09±0.02 vs 0.02±0.003，t值分别为37.5、40.0、23.0，均P<0.01)。

注：图A、C、E正常组胎盘滋养细胞p-p38、caspase-3、caspase-8的表达(×40，SAB法染色)； 图B、D、F子痫前期组胎盘滋养细胞p-p38、caspase-3、caspase-8的表达显著增强(×40，SAB法染色)；G 阴性对照。

表1 p-p38、caspase-3、caspase-8在两组胎盘滋养细胞中阳性面积表达比值

注：*与正常组比较P<0.01，有显著性意义。

2.2Western blot检测胎盘组织中p-p38、caspase-3、caspase-8的表达

子痫前期胎盘组织p-p38蛋白水平较正常妊娠组增高，显著高于其在正常妊娠组的表达(2.18±0.04 vs 1.21±0.02)，差异有统计学意义。子痫前期组胎盘组织中caspase-3、caspase-8蛋白表达水平显著高于正常妊娠组(1.72±0.03 vs 0.96±0.06、1.59±0.04 vs 0.98±0.01)，差异具有统计学意义(P<0.01)。

图2 两组孕妇胎盘组织中p-p38的蛋白表达水平

图3 两组孕妇胎盘组织中caspase-3的蛋白表达水平

图4 两组孕妇胎盘组织中caspase-8的蛋白表达水平

表2 p-p38 、caspase-3、caspase-8在胎盘组织中的表达

注：*与正常组比较P<0.01，有显著性意义。

3 讨论

3.1子痫前期的研究背景

子痫前期是产科常见的妊娠期特有疾病，严重威胁母婴健康，是导致孕产妇及围产儿病率和死亡的重要原因之一。在妊娠过程中，胎盘的功能是通过滋养细胞的增殖、凋亡、侵袭等实现的。由胎盘滋养细胞凋亡增加引起各种病理妊娠多有报道，研究认为当患者胎盘组织中多种因素引起胎盘灌流不足，胎盘缺血缺氧，促使滋养细胞过度凋亡，引起胎盘滋养细胞浸润能力下降，导致胎盘浅着床[4]，进一步使胎盘血流减少，滋养细胞凋亡急剧增加，导致病理妊娠如子痫前期、胎儿生长受限等。因此，子痫前期的发病与滋养细胞的凋亡机制密切相关。p38MAPK是重要的细胞应激信号传导通路，内外源性刺激可激活p38磷酸化，参与细胞凋亡、诱导细胞基因表达以及促进细胞增殖及分化等，研究证实激活p38MAPK磷酸化能够调节凋亡前期信号，导致细胞功能紊乱、凋亡坏死[5-6]。Caspase家族是一组在细胞凋亡机制中发挥重要作用的蛋白酶，又称为“天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶”。因此，对子痫前期胎盘组织中凋亡机制的研究，可以为子痫前期的预防和治疗提供新的理论依据。

3.2 p-p38和caspase-3、casepase-8与子痫前期发病关系研究

本研究通过免疫组化分析p-p38和caspase-3、caspse-8在胎盘组织中表达，在子痫前期组细胞滋养细胞中均可见大量棕黄色颗粒的阳性细胞。通过对其阳性面积分析可得，p-p38和caspase-3、caspse-8在子痫前期中的表达且显著高于正常孕妇对照组。通过Western blot实验方法同样证实p-p38和caspase-3、caspse-8在子痫前期患者胎盘组织中高表达，且显著高于对照组。本研究中子痫前期胎盘组织中caspase-3、caspse-8增高提示，在子痫前期中滋养细胞凋亡显著增加，进一步证实了子痫前期发病机制中滋养细胞凋亡增加的假说，与国外学者所类似研究得到的结果相一致[7]。研究结果表明，在子痫前期患者胎盘滋养细胞凋亡过程中，p38磷酸化后通过，激活caspase家族活性，激活启动caspase 8，促使效应caspase 3激活，诱导Bax/Bcl-2增加、Cox-2上调，使细胞DNA修复功能丧失，失去正常增殖分化能力形成凋亡[8]。

本研究中子痫前期胎盘组织中p-p38显著增加，提示子痫前期胎盘滋养细胞缺血缺氧引起病理损伤，可激活p38磷酸化，进而启动跨核被膜调控，可刺激机体产生过多炎性因子如TNF-α、IL-6、IL-4等，同时调节钙离子泵，使血管内皮细胞受损和功能障碍，通过增强c-myc、c-jun和c-fos基因表达、磷酸化p53，参与Fas/FasL的表达，诱导caspase家族的启动，参与和调节细胞凋亡[9]。

由此我们可以推测，子痫前期胎盘血流灌注不足，滋养细胞持续缺血缺氧，激活p-p38磷酸化，进而激活凋亡级联反应的启动者caspase-8的表达增加，通过凋亡级联反应激活细胞凋亡途径，引起执行者caspase-3随之增加，从而引起滋养细胞凋亡增加。这种改变一方面既可以解释为子痫前期的病因，目前已有研究发现子痫前期孕妇在临床症状出现以前，胎盘绒毛中已有缺氧、凋亡增加；而另一方面，在诱导滋养细胞、血管内皮细胞过多凋亡，加重胎盘功能障碍，促进子痫前期的发展[10]。

综上所述，p-p38、caspase-3、caspase-8在胎盘组织的异常表达与滋养细胞的凋亡可能是子痫前期发病因素之一，其具体机制有待进一步研究。在后续研究中，将进一步探讨p-p38、caspase-3、caspase-8在子痫前期动物模型中的表达，为预防和治疗子痫前期提供新的理论依据。

[1]谢幸,苟文丽.妇产科学[M].8版.北京：人民卫生出版社，2013:64-65.

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[4]徐佳,马向东,陈必良. 重度子痫前期患者胎盘中MMP-9和TIMP-1的表达及临床意义[J]．中国妇幼健康研究,2012, 23 (2)：183-186．

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[专业责任编辑：杨文方]

Expressions and significance of p-p38, caspase-3 and caspase-8 in placenta of patients with preeclampsia

XU Jia, LIU Duo-duo, MA Xiang-dong, CHEN bi-liang

(DepartmentofGynecologyandObstetrics,XijingHospital,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,ShaanxiXi’an710032,China)

Objective To investigate the expressions and significance of p-p38, caspase-3 and caspase-8 in placenta of patients with preeclampsia (PE). Methods Totally 80 pregnant women delivering in department of gynecology and obstetrics in Xijing Hospital during June 2016 to February 2017 were enrolled in study, and they were divided into PE group (40 cases) and control group (40 cases). P-p38, caspase-3 and caspase-8 in placenta of cases in two groups were detected with immunohistochemistry and western blot. Results P-p38, caspase-3 and caspase-8 were all expressed in placenta of cases in two groups. The levels of p-p38, caspase-3 and caspase-8 in cases in PE group were significantly higher than those in control group (2.18±0.04 vs 1.44±0.04, 1.72±0.03 vs 1.12±0.06, 1.59±0.04 vs 1.18±0.01) (tvalue was 71, 60 and 61, respectively, allP<0.01). Conclusion The abnormal expressions of p-p38, caspase-3 and caspase-8 in placenta are related to the increase of trophoblast apoptosis, and they may participate the pathogenesis of PE.

p-p38; caspase-3; caspase-8; preeclampsia (PE); trophoblast

2017-03-06

徐 佳(1984—)，主治医师，硕士，主要从事围产医学与妇科肿瘤的研究。

陈必良，教授/博导。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.08.024

R714.2

A

1673-5293(2017)08-0961-04