自拟解酒护肝汤对酒精性肝炎模型大鼠的保护作用

马阮昕 王晓东 江晓妹

自拟解酒护肝汤对酒精性肝炎模型大鼠的保护作用

马阮昕 王晓东 江晓妹

目的探讨自拟解酒护肝汤对酒精性肝炎模型大鼠的肝脏保护作用。方法将SD大鼠随机分为6组，每组10只。将大鼠按体重用56%酒精给予灌胃，7 mL/kg，1天1次，持续4周。从造模后第5周起，阳性对照组灌胃给予西乐葆0.05 mg/kg，解酒护肝汤治疗组分别给予灌胃低、中、高剂量(5.0 mg/kg，15.0 mg/kg，30.0 mg/kg)，持续30天。末次给药后，经腹主动脉取血，以及取肝脏组织，称重固定。随后试剂盒检测血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷氨酸氨基转移酶(aspartate transaminase，AST)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)，ELISA和免疫组化法分别检测血清和肝脏肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)，HE染色观察肝脏组织形态。结果与模型对照组比较，解酒护肝汤各剂量组的ALT、AST显著减少(P<0.05)，解酒护肝汤中、高剂量组的MDA、TNF-α显著减少(P<0.05)。解酒护肝汤高剂量组的肝脏脏器系数显著下降(P<0.05)。解酒护肝汤各剂量组肝脏TNF-α表达均有一定程度减少。结论自拟解酒护肝汤对酒精性肝炎模型大鼠肝脏有一定的保护作用。

解酒护肝汤； 酒精性肝炎； 血清； 大鼠； 肿瘤坏死因子α

酒精性肝病是由于长期大量饮酒导致的肝脏疾病，酒精性肝炎是酒精性肝病的一种病症[1-2]。近年来，中国由酒精所致肝损害的发病率亦呈逐年上升趋势，酒精已成为继病毒性肝炎后导致肝损害的第二大病因[3]。中医学虽无酒精性肝病之称，但有论治“伤酒”“胁痛”“黄疸”等病证的文献[4]。因此，中医治疗酒精性肝病有独特之处，本实验采用自拟解酒护肝汤对酒精性肝炎大鼠的作用进行研究。

1 材料与方法

1.1 动物

SD大鼠60只，雄性，体重180～220 g，8周龄，由广东省实验动物监测所提供，实验动物生产许可证号:SCXK(粤)2008-0020，动物适应3天后进行实验。

1.2 药物

自拟解酒护肝汤的药物组成：葛根20 g、连翘20 g、石菖蒲20 g、茵陈20 g、虎杖20 g、柴胡20 g、甘草10 g，水煎煮，浓缩后生药量为2 g/L。

1.3 试剂与仪器

兔IgG-免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司，型号：SV1022)，Rat-TNFα ELISA试剂盒(BIOVALUE公司，批号：BV-E13052505)，丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)试剂盒、谷氨酸氨基转移酶(aspartate transaminase，AST)试剂盒和丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20130402)，葛根、连翘、石菖蒲、茵陈、虎杖、柴胡和甘草(广州市岭南中药饮片有限公司，批号：131101)，赛科希德SA-5000自动血流变测试仪(北京寒科希特科技发展有限公司)，BX50F-3型OLYMPUS显微镜(日本奥林巴斯公司)，FA(N)/JA(N)系列电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司)，Bio-Rad 450型酶标仪。

1.4 动物模型及分组

SD大鼠随机分为6组，每组10只。空白对照组给予等体积生理盐水，分次灌胃，持续4周。阳性对照组、模型对照组和解酒护肝汤治疗组均按体重用56%酒精给予灌胃，7 mL/kg，1天1次，持续4周[5]。从造模后第5周起，阳性对照组和解酒护肝汤治疗组分别灌胃给予西乐葆0.05 mg/kg，解酒护肝汤低、中、高剂量(5.0 mg/kg，15.0 mg/kg，30.0 mg/kg)，持续30天；空白对照组和模型对照组则分别给予等体积生理盐水灌胃，持续10天。末次给药后禁食24小时，10%水合氯醛(35 mg/kg)腹腔内注射麻醉，所有动物经腹主动脉取血，取肝脏组织分别在10%福尔马林和4%多聚甲醛中固定。

1.5 实验指标

生化指标测定：血清中MDA、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)检测分别严格按试剂盒要求操作。血清转氨酶的变化：全自动生化检测仪检测血清AST、ALT含量。肝脏的脏器系数：通过各组大鼠肝脏的质量与相应的大鼠体重的比值来计算出肝脏的脏器系数。肝组织病理学检查：常规石蜡包埋、切片，HE染色，光镜下观察肝脏组织学变化。肝组织TNF-α的免疫组化检查：常规石蜡包埋，作5 μm切片，免疫组化SABC法染色，DAB显色。以组织细胞胞浆中出现棕黄色沉淀，染色强度高于背景非特异性染色者为阳性表达，用磷酸盐缓冲液作为阴性对照。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 解酒护肝汤对酒精性肝炎大鼠的生化指标的影响

与空白对照组比较，模型对照组的MDA、TNF-α显著增加(P<0.01)；与模型对照组比较，阳性对照组，解酒护肝汤中、高剂量组的MDA、TNF-α都显著减少(P<0.05)。见表1。

表1 解酒护肝汤对酒精性肝炎大鼠的MDA、TNF-α的影响

注： 与模型对照组比较，aP<0.05，bP<0.01。

2.2 解酒护肝汤对酒精性肝炎大鼠的血清转氨酶的影响

与空白对照组比较，模型对照组的ALT、AST显著增加(P<0.01)；与模型对照组比较，阳性对照组，解酒护肝汤低、中、高剂量组的ALT、AST都显著减少(P<0.01)。见表2。

表2 解酒护肝汤对酒精性肝炎大鼠的血清ALT、AST的影响

注： 与模型对照组比较，aP<0.01。

2.3 解酒护肝汤对酒精性肝炎大鼠的肝脏脏器系数的影响

与空白对照组比较，模型对照组的肝脏脏器系数显著减少(P<0.05)；与模型对照组比较，阳性对照组、解酒护肝汤高剂量组的肝脏脏器系数都显著增加(P<0.05)。见表3。

表3 解酒护肝汤对酒精性肝炎大鼠的肝脏脏器系数的影响

注： 与模型对照组比较，aP<0.05。

2.4 解酒护肝汤对酒精性肝炎大鼠肝脏病理组织的影响

图1结果呈示，空白对照组大鼠肝小叶清晰，肝细胞索排列尚整齐，未见肝细胞胞质疏松化，炎细胞浸润。模型对照组大片肝细胞胞质疏松化，肝细胞索紊乱，有灶性炎症细胞浸润及轻度纤维增生。浸润的炎细胞以淋巴细胞为主，未见纤维间隔形成。阳性对照组与解酒护肝汤治疗组肝小叶结构完整，肝细胞胞质轻度疏松化，较模型组轻，未见明显炎细胞浸润及纤维增生。阳性对照组、解酒护肝汤治疗组与模型对照组大鼠的肝脏病理比较，炎症及纤维化增生程度均比模型对照组轻，这提示解酒护肝汤有减轻酒精引起的肝细胞的炎症程度。

2.5 解酒护肝汤对酒精性肝炎大鼠肝脏TNF-α表达的影响

图2结果呈示，空白对照组没有TNF-α的表达，在模型对照组及解酒护肝汤各剂量组都有TNF-α的表达，可观察到模型对照组的棕黄色较深，而解酒护肝汤低、中、高剂量组的棕黄色逐渐变浅，且棕黄色的范围也逐渐减少。

3 讨论

酒精性肝病的病因主要是乙醇在肝细胞内分解代谢，乙醇在肝细胞质的乙醇脱氧酶的作用下氧化为乙醛，乙醛为高活性化合物，能干扰肝细胞多方面的功能[1-2]，引起肝细胞代谢紊乱，使肝细胞变性和坏死，并发炎症反应以及胶原纤维和结节增生[6]。自拟解酒护肝汤方中的柴胡、茵陈、虎杖、葛根清利肝胆湿热，柴胡行气活血化瘀，葛根有解酒毒之功，甘草调合药性，诸药配合，共奏护酒肝、解酒毒，改善肝功能作用。

ALT主要存在于肝细胞浆内，当肝细胞损伤时，细胞内转氨酶可进入血中，引起血ALT升高。

注：A空白对照组;B模型对照组;C阳性对照组；D解酒护肝汤低剂量组；E解酒护肝汤中剂量组；F解酒护肝汤高剂量组

注：A空白对照组；B模型对照组；C阳性对照组；D解酒护肝汤低剂量组；E解酒护肝汤中剂量组；F解酒护肝汤高剂量组

AST、γ-GT、LDH也存在于肝细胞浆内，AST分布于线粒体内，当肝细胞损害严重时，线粒体内AST释放入血，使血清AST升高大于ALT[7]。由于整个肝脏内转氨酶含量约为血中含量的100倍，所以肝脏实质性损害时，只要有1%的肝细胞坏死，就可使血清酶活性增加1倍。当细胞膜通透性增加时，即使无坏死，因肝细胞内转氨酶浓度高于血清1000～5000倍，可顺浓度差而释放入血[8]。因此转氨酶是肝细胞损害的敏感标志，也是乙醇所致肝损伤最敏感的指标。

MDA是自由基攻击膜不饱和脂肪酸的产物，可以与蛋白质的游离氨基作用，引起蛋白质分子内和分子间交联，导致细胞损伤[9]。正常生理状态下，体内的MDA含量是极低的，其含量的高低可以反映机体细胞受到自由基攻击的程度。国内外大量研究表明，肝脏库否氏细胞和肝血窦内皮细胞经活化后大量分泌的TNF-α等细胞因子是引起肝细胞坏死的重要介质，TNF-α的产生是酒精性肝损伤最早的反应之一[10-11]。

本研究结果观察到，模型对照组的ALT、AST、MDA和TNF-α比空白对照组显著增加，符合酒精性肝炎的临床基本指征[4]。与模型对照组比较，解酒护肝汤各剂量组的ALT、AST都显著减少(P<0.01)，这说明解酒护肝汤对模型大鼠肝脏损伤有减缓作用；解酒护肝汤中、高剂量组的MDA显著减少(P<0.01)，这说明解酒护肝汤有抗氧化的作用；解酒护肝汤各剂量组的肝脏TNF-α表达都减少，说明解酒护肝汤对模型大鼠肝脏有抗炎作用；解酒护肝汤高剂量组的肝脏脏器系数显著减少(P<0.05)，各剂量组肝脏炎症及纤维化增生程度减轻，说明解酒护肝汤对模型大鼠的肝脏有保护作用。

综上所述，自拟解酒护肝汤对酒精性肝炎模型大鼠可以缓解肝脏损伤，有抗氧化和抗炎作用，为自拟解酒护肝汤在临床应用提供了实验依据。

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(本文编辑： 禹佳)

EffectsofJiejiuHuganDecoctiononAlcoholicHepatitisinRats

MARuanxin，WANGXiaodong，JIANGXiaomei.

TheSixthAffilitedHospitalOfSUNYatsenUniversity，Guangzhou510655,China

ObjectiveTo study the effects ofJiejiuHuganDecoction on alcoholic hepatitis in rats.MethodsSD rats were randomly divided into 6 groups (n=10). Model preparation was gastric gavage with 35% alcohol (15 ml/kg) for 4 weeks, once a day. After models were built, positive control group was given celebrex 0.05 mg/kg, and protect liver soup group was given,JiejiuHugandecoction low, medium and high dose (5.0 mg/kg, 15.0 mg/kg, 30.0 mg/kg) for 30 days. After the last administration, blood was collected by abdominal aortic blood, and liver tissue was weighed and fixed. The serum ALT, AST and MDA were detected. TNF-α in serum and liver was detected by ELISA and immunohistochemical method. And the HE staining was used to observe liver.ResultsCompared with the model group, the level of ALT, AST, MDA and TNF-α ofJiejiuHugandecoction was significantly reduce(P<0.05). The expressions of TNF-alpha and organ coefficients in liver were reduced inJiejiuHugandecoction groups and liver damage was slowed down.ConclusionJiejiuHugandecoction has a protect effect on alcoholic hepatitis in rats.

JiejiuHuganDecoction; alcoholic hepatitis; Serum; Rats; TNF-α

510655 广州，中山大学附属第六医院药学部(马阮昕、王晓东)；中山大学附属第一医院药学部(江晓妹)

马阮昕(1986-)，女，本科，初级药师。研究方向：药学研究。E-mail：657078890@qq.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.08.002

2016-07-03)