菊花去饱和酶CmSAD基因的克隆与表达分析

张华奥， 逯久幸， 李 静， 李永华

(河南农业大学林学院，河南 郑州 450002)

菊花去饱和酶CmSAD基因的克隆与表达分析

张华奥， 逯久幸， 李 静， 李永华

(河南农业大学林学院，河南 郑州 450002)

以秋菊(ChrysanthemummorifoliumRamat.)抗寒品种‘星光灿烂’为材料，利用RT-PCR和RACE方法从叶片中克隆△9硬脂酰-ACP去饱和酶(Stearoyl-ACP desaturase，SAD)基因，命名为CmSAD，GenBank登录号为KC529335。该基因cDNA全长1 203 bp，编码401个氨基酸，相对分子质量为45.57 kD，等电点为6.48，编码的氨基酸序列与新疆雪莲同源性最高(80.29%)。通过对该蛋白进行生物信息学分析得出其没有跨膜结构，主要存在于叶绿体基质中，N端含有一段包含60个氨基酸的叶绿体转运肽。通过实时荧光定量PCR研究低温胁迫下叶片和根系中CmSAD基因的表达量变化，该基因在叶片和根系中均有表达。根系中CmSAD基因的表达量随着温度的降低而降低，16 ℃时表达量最高；叶片中CmSAD表达量随着温度的降低先升高再降低，5 ℃时最高。随着温度的降低，菊花叶片和根系中CmSAD基因的表达情况表现出一定的差异。CmSAD基因的表达变化与温度有关，为低温胁迫下菊花脂肪酸代谢的分子机理研究提供了基础。

菊花；低温；CmSAD基因；克隆；表达分析

△9硬脂酰-ACP去饱和酶(Stearoyl-ACP desaturase，SAD)是影响植物细胞膜脂肪酸不饱和程度的最直接因素，细胞膜相变温度的高低取决于膜脂不饱和度，SAD 是催化不饱和脂肪酸合成的关键酶[1-2]。研究人员已从红花、银杏等70余种植物中克隆出了SAD基因[3]。KACHROO等[4]研究表明，SAD参与到拟南芥的防御和生长调节过程中，罗秀芹等[5]对SAD的结构和功能进行了预测。对白蜡树的研究表明，SAD基因在白蜡茎中表达量较高[6]。菊花(ChrysanthemummorifoliumRamat.)是多年生宿根草本花卉，对其栽培技术、低温抗性生理、引种与园林应用等方面已有较多研究[7-8]。但有关脂肪酸代谢的分子机理研究报道较少。此前已有学者研究了低温下4种秋菊叶片根系中膜脂脂肪酸的组分变化[8]和9个秋菊品种叶片脂肪酸组分与抗寒性[9]；并通过对低温下菊花叶绿体ω-3脂肪酸去饱和酶(CmFAD7)基因的研究发现，其表达量的高低与温度、品种及器官有关[10]，ω-3脂肪酸去饱和酶作为影响质膜脂肪酸组成的另一重要因素，对CmSAD的研究提供了重要参考依据。本试验以秋菊(ChrysanthemummorifoliumRamat.)抗寒品种‘星光灿烂’为试材，从叶片中克隆CmSAD基因全长cDNA，测定低温胁迫下CmSAD基因在叶片和根系中的表达量变化，分析低温与CmSAD基因表达的关系，为进一步探讨菊花抗寒的生理与分子机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1试验材料与处理

以秋菊抗寒品种‘星光灿烂’为试材(由开封市园林菊花研究所提供)，盆栽基质为V(草炭)∶V(蛭石)∶V(珍珠岩)=1∶1∶1。选取生长健壮的菊花幼苗，待株高为(20±2)cm，叶片数为13±1时进行处理。

试验设4种温度处理：16、5、-4和-8 ℃(菊花半致死温度为-8 ℃左右，最适生长温度约为16 ℃)。将供试菊花植株冲洗干净，放入塑料瓶中，置于高精度低温恒温槽中(GDH-1006，Scientz，宁波)进行不同温度处理，3次重复。匀速降温2 ℃·h-1，当达到所要求的温度后维持12 h，取样。在每个处理温度下，取植株根系和顶端下第4～5片叶，蒸馏水反复冲洗后用定性滤纸吸干，锡箔纸包好后于液氮中速冻，-80 ℃保存，用于基因克隆和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)。

1.2试验方法

1.2.1CmSAD基因的克隆 采用改良CTAB法提取RNA，以菊花叶片总RNA为模板，利用5′RACE试剂盒(SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit)反转录cDNA，具体步骤参考赵桂红等[11]的方法。

依据蓖麻、木薯、麻疯树、乌桕和油桐等物种在GenBank中已有的SAD同源基因的保守区域，合成简并引物SAD-F1和SAD-R2(表1)，以cDNA为模板对菊花SAD的中间片段进行扩增, 扩增中间片段的PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性40 s，50 ℃退火50 s，72 ℃延伸90 s，30个循环， 72 ℃后延伸5 min；根据中间片段核苷酸序列，设计合成3′RACE正向特异性引物SAD3′-F(表1)，以cDNA作为模板，进行PCR扩增，获得3′端序列, 3′RACE扩增反应程序与扩增中间片段相同，但退火温度为54 ℃；根据中间片段核苷酸序列，设计合成5′RACE两个下游的特异性引物：SAD5′-R1(外侧引物)，SAD5′-R2(内侧引物)(表1)，采用巢式PCR克隆5′端序列，5′RACE扩增反应程序：95 ℃ 预变性5 min，95 ℃变性30 s，70 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，5个循环；95 ℃变性30 s，66 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，10个循环；95 ℃变性30 s，62 ℃退火30 s，2 ℃延伸90 s，23个循环，72 ℃延伸5 min。将克隆得到的菊花SAD基因的3′端、5′端及中间片段进行拼接获得全长，设计SAD基因cDNA全长特异性引物SAD-S和SAD-A(表1)，进行cDNA全序列扩增。其扩增程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性40 s，52 ℃退火50 s，72 ℃延伸90 s，30个循环，72 ℃后延伸5 min。

表1 PCR扩增所需引物Table 1 Primers used in PCR amplification

1.2.2CmSAD基因序列分析 利用DNAMAN6.0对已经完成测序的核苷酸序列进行氨基酸序列的推测与比对；利用NCBI网站[12]上的BLASTP(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)进行蛋白预测，用specialized BLAST(CDD search)完成保守区域分析；用在线ProtParam软件(http://web.expasy.org/protparam/)进行蛋白质理化性质的分析；利用ProtScale(http://web.expasy.org/protscale)进行蛋白质疏水性的分析；用SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.plpage=npsa_sopma.html)软件进行二级结构分析；利用Tmpred(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)分析蛋白的跨膜区和跨膜方向；采用Sosuisignal(http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/sosuisignal/ sosuisignal_submit.html)软件进行信号肽预测；用PSORT(http://psort.hgc.jp/form.html)和TargetP(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)进行亚细胞定位预测；运用 Swiss-Model Workspace(http://swissmodel.expasy.org/)在线进行3D 结构预测。

1.2.3CmSAD基因在低温胁迫下的表达分析 提取4种温度处理下菊花根系和叶片总RNA，进行反转录。以cDNA为模板，用引物SAD1-F和SAD1-R(表1)进行实时荧光定量PCR，以18s-rRNA(18s-rRNA F1、18s-rRNA R2)(表1)作为内参基因，每个样品3次重复。用18s-rRNA作为比对进行溶解曲线分析，并以β-微管蛋白(β-tubulin)基因作为对比基因与各基因表达量进行相对定量分析。按照2-ΔΔCT法计算基因的相对表达量。

2 结果与分析

2.1CmSAD基因的克隆

提取菊花叶片总RNA用于RT-PCR反应，获得保守区片段，得到长度大约为690 bp(图1，S1)DNA片段的条带。通过菌液PCR验证，基因测序，经Blast分析，其核苷酸的序列与已知物种中的CmSAD基因有较高的同源性，表明该片段就是所需目的基因的中间片段。

M:DNA分子量标记DL 2 000。 M: DNA marker DL 2 000.图1 CmSAD基因中间片段(S1)和基因cDNA全长(S7)Fig.1 CmSAD gene middle fragment(S1)and complete sequence of CmSAD cDNA(S7)

依据所得的CmSAD基因的中间片段，分别进行3′和5′RACE，获得基因序列的3′端和5′端。将从菊花中克隆出来的SAD基因的3′端、5′端及中间片段进行拼接获得全长序列。以SAD-S和SAD-A为引物，以cDNA为模板，获得大小约为1 250 bp的条带，进行酶切验证并测序。该基因编码区全长1 203 bp，编码 401 个氨基酸(图1，S7)， GenBank注册号为KC529335。

2.2CmSAD基因序列同源性分析及分子进化树构建

使用 Blast 软件对氨基酸同源序列搜索，菊花SAD基因编码的氨基酸序列与同科的新疆雪莲和向日葵SAD基因的同源性最高，分别为 80.29%、79.81%。与菊花SAD的氨基酸序列具有较高同源性的物种有麻疯树(77.62%)、百脉根(75.91%)、马铃薯(77.86%)、水黄皮(77.62%)、花生(77.13%)、乌桕(76.89%)、木薯(76.89%)等(图2)。因此，将该基因命名为CmSAD。通过与SAD基因的比较，CmSAD基因在上游23、24位置中多出2个丝氨酸(S)。

利用MEGA4.0软件对其氨基酸序列进化树分析(图3)，CmSAD基因与同科的新疆雪莲和向日葵SAD基因最先聚合，表现出较近的亲缘关系，其次是花生、大豆、菜豆，而与木油桐、油桐、乌桕、麻疯树、木薯的亲缘关系较远。由此可知，菊花CmSAD基因与同科植物有较近的亲缘关系，与木本植物的亲缘关系较远。

2.3CmSAD基因编码蛋白的生物信息学分析

CmSAD基因编码蛋白包含401个氨基酸，其分子式为C2030H3167N557O597S20，相对分子质量为45.57 kD，等电点(pI)为6.48。该蛋白具有稳定性(稳定系数为36.24)，其脂肪系数为75.44，具亲水性，平均亲水系数为-0.412。由20种氨基酸构成菊花：KC529335；新疆雪莲：ABF66638；向日葵：AAB65145.1；麻疯树：AAY86086.1；百脉根：AAY78547.1；马铃薯：XP_006350702.1； 水黄皮：AGS43806.1； 花生：ADB79570.1；乌桕：ABN13874.1；木薯：AFT92043.1。

黑色背景表示序列一致性为100%；深灰色表示序列一致性≥75%；浅灰色表示序列一致性≥50%。Chrysanthemummorifolium：KC529335；Saussureainvolucrata：ABF66638；Helianthusannuus：AAB65145.1；Jatrophacurcas：AAY86086.1；Lotusjaponicus：AAY78547.1；Solanumtuberosum：XP_006350702.1；Millettiapinnata：AGS43806.1；Arachishypogaea：ADB79570.1；Triadicasebifera：ABN13874.1；Manihotesculenta：AFT92043.1.

Black background indicates 100% sequence homology, dark gray background indicates amino acid with≥75%, and light gray background indicates amino acid with≥50%.

图2菊花与其他物种△9硬脂酰-ACP去饱和酶氨基酸序列的多重比对
Fig.2Alignmentofaminoacidof△9Stearoyl-ACPdesaturasefromchrysanthemumandotherplants

此蛋白，Leu的含量最丰富(大约占8.2%)，有52个带负电氨基酸(Asp+Glu)和49个带正电氨基酸(Arg+Lys)。在CmSAD中包含1个由297个氨基酸残基构成的保守区，属酰基-ACP去饱和酶家族(Acyl-ACP-Desaturase)。对其二级结构分析，SAD蛋白含有α-螺旋213个，占53.12%；β-折叠27个，占6.73%；β-转角42个，占10.47%；自由卷曲119个，占29.68%。该蛋白没有跨膜结构；对该蛋白亚细胞定位进行分析，主要存在于叶绿体基质中。N-端含有一段包含60个氨基酸的叶绿体转运肽，位于第1-60位。没有明显的信号肽，是一个可溶性蛋白。活性位点分析表明，C-端有1个SAD的保守区，5个蛋白激酶C磷酸化位点，4个酪蛋白激酶II磷酸化位点，3个N-端酰基化位点，1个酪氨酸激酶磷酸化位点，1个cAMP和cGMP调节蛋白激酶磷酸化位点，1个酰胺化位点。通过SWISS MODEL进行3D结构预测，该基因编码蛋白具有与硬脂酰去饱和酶相似的理化性质。

2.4不同温度下CmSAD基因在叶片和根系中的表达

CmSAD基因在植物不同器官中的表达受温度影响(图4)。根系中CmSAD基因的表达量随着温度的降低而降低，16 ℃时表达量最高，5 ℃、-4 ℃和-8 ℃分别是16 ℃的0.87、0.11和0.03倍。随着温度的下降，叶片中CmSAD基因的表达量先升高再降低，5 ℃时表达量达到最高，16 ℃、-4 ℃和-8 ℃分别是5 ℃的0.77、0.18和0.07倍。在不同低温环境中，CmSAD基因在植物各器官内的表达量也不相同。在16 ℃和5 ℃时，CmSAD基因在叶片与根系中表达量差异显著，根系中的表达量高于叶片，当温度下降到-4 ℃和-8 ℃时，叶片中CmSAD的表达量高于根系，各处理之间差异显著。

比例尺代表0.05个氨基酸差别；节点上数字表示bootstrape的校验结果。 The scale bar represents 0.05 amino acid substitutes per site；Numbers at nodes indicate phylogeny test and options.图3 不同植物△9硬脂酰-ACP去饱和酶基因进化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of △9 Stearoyl-ACP desaturase gene from different plants

图4 低温下CmSAD基因在菊花叶片和根系中的表达Fig.4 CmSAD gene expression level in leaves and roots of Chrysanthemum under low temperature

3 讨论

△9硬脂酰-ACP去饱和酶是目前研究较为广泛的Acyl-ACP去饱和酶，已经从70余种植物中克隆出了SAD基因。本试验从菊花叶片中克隆得到CmSAD基因，cDNA全长1 203 bp，编码401个氨基酸，相对分子量为45.57 kD。通过氨基酸序列同源性分析，CmSAD具有较高的保守性，与新疆雪莲和向日葵 SAD 基因的同源性最高，CmSAD基因在上游 23、24位置中多出 2 个丝氨酸(S)，L-丝氨酸羟基经磷酸化作用后能衍生出的磷丝氨酸，是磷脂的主要成分之一[13]，它可能与细胞膜稳定性有关。从蓖麻和麻疯树等植株中克隆获取的SAD氨基酸序列的N-端均包含转运肽，为叶绿体转运肽；利用Psort分析该蛋白定位在叶绿体基质中，在C-端发现1个SAD的保守区域序列：SAVAQRL GVYTAKDYADILE，由此推测出CmSAD基因编码蛋白是一个定位于叶绿体内的硬脂酰-ACP脱去饱和酶，催化硬脂酰-ACP(18:0-ACP)在其中介入第1个双键而生成油酰基-ACP(18:1-ACP)[14]。

自1991年THOMPSON等[15]从红花中首次克隆出CmSAD基因，目前在GenBank上登记的SAD基因序列或序列片段达70多个，并对SAD基因的结构和功能进行了研究。SLOCOMBE等[16]研究发现SAD在发育的植物组织中(如幼嫩叶，正发育的果实)表达非常旺盛，具有时间和组织特异性。通过对拟南芥fab2突变株(SAD基因突变)进行研究，高温有利于fab2的生长[17]。白银豆中的PlSAD基因在根和茎中表达量极低，而在叶片中较高。低温条件下PlSAD的表达量下降，但在遮光处理后其表达量增加。本试验中，根系中CmSAD的表达量随着温度降低而降低，16 ℃时表达量最高；随着温度降低，叶片中CmSAD的表达量呈先升高再降低的趋势，5 ℃时最高。陈罡等[6]对美国白蜡的研究结果表明， SAD 基因在白蜡茎中表达量最高，叶片中最低。本试验中，在16 ℃和5 ℃时，CmSAD基因在根系中的表达量高于叶片，而温度降至-4 ℃和-8 ℃时，叶片中CmSAD的表达量高于根系，CmSAD基因的表达受低温调控。△9硬脂酰-ACP去饱和酶基因是去饱和酶基因家族中的一部分，调控机制相当复杂，膜脂脂肪酸组成及相关基因表达作为菊花低温胁迫响应的关键机制，CmSAD基因及其家族的功能和调控机理的研究还需进一步深入。

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(责任编辑：李莹)

CloningandexpressanalysisoffattyaciddesaturasegeneCmSADinchrysanthemum

ZHANG Huaao， LU Jiuxing， LI Jing， LI Yonghua

(College of Forestry, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002， China)

Chrysanthemum (ChrysanthemummorifoliumRamat.) variety of cold resistance ‘Xingguangcanlan’ was selected as experimental materials. △9 Stearoyl-ACP desaturase (SAD) gene were separated and cloned from the leaf by RT-PCR and RACE, namedCmSAD, accession number is KC529335 in GenBank. The full length cDNA ofCmSADis 1203 bp， encoding a protein of 401 amino acids. Its molecular mass is 45.57 kD， pI is 6.48, and the homology of coding sequence of amino acids is the highest withSaussureainvolucrata(80.29%). This protein has no transmembrane structure, and mainly exists in the chloroplast stroma, and a chloroplast transit peptide at N-terminal, which contains 60 amino acids. Quantitative PCR research by real-time fluorescent was conducted on quantity alteration in leaves and root under low temperature stressCmSADgene expression. The expression quantity ofCmSADgene decreased in root system with temperature decreasing. When the temperature was 16 ℃, the expression quantity ofCmSADgene was the highest. With the decrease of temperature, the expression quantity ofCmSADgene in leaves increased first and achieved the highest at 5 ℃, then decreased. Different temperatures made diffident expression quantity ofCmSADgene. With the decrease of temperature, the expression quantity ofCmSADgene decreased. Therefore, the expression quantity ofCmSADgene was related to temperature and it also had a close relationship with cold resistance.

chrysanthemum； low temperature；CmSAD； cloning； expression analysis

S682.11

：A

2016-10-24

河南省科技攻关项目(142102110136)

张华奥(1992-)，女，河南南阳人，硕士研究生，从事园林植物与观赏园艺研究。

李永华(1974-)，男，河南西华人，教授，博士。

1000-2340(2017)03-0324-06