改进液氮冻融法和试剂盒法提取粪便基因组DNA对比研究

王宁++王占黎++包艳?++刘琦琦

摘 要： 目的 比较两种方法提取粪便细菌基因组DNA的效果。方法 收集30例健康人的粪便，采用改进的液氮冻融法及试剂盒法提取DNA，对总产量和纯度进行分析。PCR扩增细菌16S rDNA基因序列，比较不同方法提取人粪便基因组DNA效率的差异。结果 采用改进的液氮冻融法提取和试剂盒法提取的DNA浓度分别为784±69.13 ng/μl、209.98±39.30 ng/μl（F=505.085，P<0.001）。结论 试剂盒法在提取基因组DNA纯度优于改进液氮冻融法。但改进液氮冻融法的优点是提取基因组DNA浓度高，满足后期使用条件的前提下，提取费用相对较低。

关键词： 粪便；细菌基因组DNA；聚合酶链式反应

【中图分类号】G710

一 材料与方法

1 样品的采集与储存

以灭菌过的粪便取样盒采集30份体检正常的20-30岁志愿者的新鲜粪便样本，并在采集后30 min内送至实验室，于-20 ℃冻存，备用。

2 粪便细菌基因组DNA提取方法

改进的液氮冻融法：粪便前处理[2]：称取200 mg粪便，加入30 mL PBS涡旋震荡，使样本均匀浑浊。200×g离心5 min，收集上清弃去沉淀。重复洗涤3次。9000×g离心5 min，重复洗涤3次。倒弃上清，留沉淀。加入4 mL PBS缓冲液，取1 mL移入1.5 mL离心管中，-20 ℃冻存。DNA提取：8000×g离心5 min，倒弃上清收集沉淀。加入500 μL TE缓冲液，震荡重悬。至液氮中冻结，取出后放入65 ℃水浴融化，反复冻融3次。再加入60 μL 10%SDS和2 μL 100 mg/mL RNase A，55 ℃水浴30 min。加入10 μL 蛋白酶K，混匀后于37 ℃摇床摇4 h。加80 μL CTAB和80 μL NaCl，混匀65 ℃水浴20 min。加750 μL苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），12000×g离心10 min。取上清，加750 μL氯仿：异戊醇（24：1），。12000×g离心10 min，取上清，重复上述步骤。在上清液中加500 μL预冷异丙醇混合。12000×g离心10 min，弃去上清，在沉淀中加1 mL 75%乙醇冲洗沉淀。在室温中晾干乙醇。用60 μL TE溶解DNA。4 ℃放置过夜后置于-20 ℃冻存。

粪便基因组DNA提取试剂盒法：按TIANamp Stool DNA Kit 说明书进行。

3 DNA溶液浓度及纯度测定

粪便总DNA通过紫外微量分光光度计定量检测提取DNA浓度，用OD260/280检测提取DNA的纯度。

4 提取DNA的PCR有效性分析

PCR反应条件：95 ℃预变性4 min；……