水酶法提取葡萄籽油和蛋白质的研究

李丹丹，杨宏志，梁 英，朱 磊

(黑龙江八一农垦大学 食品学院，黑龙江 大庆 163319)

油脂加工

水酶法提取葡萄籽油和蛋白质的研究

李丹丹，杨宏志，梁 英，朱 磊

(黑龙江八一农垦大学 食品学院，黑龙江 大庆 163319)

为充分利用葡萄酿酒后的副产物，对水酶法提取葡萄籽中的油脂和蛋白质的工艺进行优化，并研究不同干燥方法和提取方法对葡萄籽油提取量和理化性质的影响。结果表明：最优提取条件为纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶、胰蛋白酶质量比2∶1∶2∶1、pH 6.5、料液比1∶9、酶解时间9 h，在此条件下，葡萄籽油提取量为99.47 mg/g，蛋白质提取量为74.86 mg/g，蛋白质提取率为57.58%；不同干燥方法对水酶法提取葡萄籽油的提取量和理化性质影响显著，从油的提取量、品质和成本考虑，在生产中应优先选择风干的干燥方式；与传统方法相比，水酶法提取的葡萄籽油品质更好，并可以直接得到副产物蛋白质，但是提取效率不够理想，有待进一步研究。

水酶法；葡萄籽油；蛋白质；提取量；理化性质

Abstract：In order to make full use of byproducts of grapes after brewing,the extraction processes of oil and protein from grape seeds by aqueous enzymatic method were optimized,and the effects of different drying and extraction ways on the extraction amount and physicochemical properties of grape seed oil were investigated.The results showed that the optimal extraction conditions were obtained as follows: mass ratio of cellulose,pectinase,xylanase and trypsin 2∶1∶2∶1,pH 6.5,ratio of material to liquid 1∶9 and enzymolysis time 9 h.Under these conditions,the extraction amount of grape seed oil,extraction amount and extraction rate of protein were 99.47,74.86 mg/g and 57.58%,respectively.Different drying ways had obvious influences on the extraction amount and physicochemical properties of grape seed oil.Consideration from extraction amount of oil,quality and cost,air drying should be preferred in production.Compared with traditional methods,the quality of grape seed oil extracted by aqueous enzymatic method was better,and the protein byproducts could be obtained directly.However,the extraction efficiency was not ideal enough,which need further studies.Keywords：aqueous enzymatic method; grape seed oil; protein; extraction amount; physicochemical property

葡萄籽中含有大量的脂类、蛋白质和多酚类物质[1]。葡萄籽油占葡萄籽质量的14%～17%，含有大量以亚油酸为主的不饱和脂肪酸、植物甾醇和白藜芦醇等生物活性成分，还含有多种维生素和矿物质[2-3]。研究发现，葡萄籽油可以清除沉积的血清胆固醇[4-5]，促进前列腺素合成[6]，还有营养脑细胞、调节神经功能等作用[7]。葡萄籽油主要应用于食品营养、医疗保健以及日用化妆品等领域。葡萄籽制油后的饼粕中含有13%～16%的蛋白质[8]，富含18种氨基酸，包括人体必需的8种氨基酸[9]，是一种优质蛋白质资源，因此可利用葡萄籽蛋白生产复合蛋白，应用于功能食品和保健药品等领域。目前，葡萄籽的开发利用已经引起国内外的广泛关注，但主要集中在葡萄籽抗氧化物质的提取和利用，而有关葡萄籽油和蛋白质的提取利用报道较少。

葡萄籽油的传统提取方法是压榨法和溶剂萃取法。压榨法效率低、能耗大、蛋白质易变性，而溶剂萃取法的缺点是杂质多和溶剂残留[10]。水酶法是近年新兴的一种提油工艺，以机械和酶解为主要手段使植物细胞壁破碎，通过酶降解油料细胞中的脂蛋白和脂多糖等复合体来破坏油料在磨浆等过程中形成的包裹在油滴表面的脂蛋白膜，从而释放油脂，提高游离油提取量[11]。水酶法提油工艺最早被用于椰子，随后又逐渐用于油菜籽、棉籽、葵花籽、可可和棕榈油等[12]。水酶法可以在温和条件下同时提出油籽中的油脂和蛋白质，较大程度上避免了对油脂和蛋白质的破坏。因此，与传统方法相比，水酶法提取的葡萄籽油品质更好、蛋白质变性程度更小、色泽更加透明澄清[13]。水酶法由于酶解在水相中进行，磷脂进入水相，因而不需要脱胶处理，不仅能减少化学精炼的步骤，还能提高葡萄籽油的品质[14]。

本文通过单因素实验和正交实验优化水酶法提取葡萄籽油和蛋白质的工艺条件，并探讨不同干燥方法和提取方法对葡萄籽油提取量和理化性质的影响，以期为葡萄副产物的充分利用以及工业化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

山葡萄籽，取自黑龙江八一农垦大学食品学院酿酒皮渣；果胶酶(酶活≥500 U/mg)、纤维素酶(酶活≥0.3 U/mg)、胰蛋白酶(酶活≥2 500 U/mg)、木聚糖酶(酶活≥2 000 U/mg)，购于美国Sigma公司；考马斯亮蓝G-250、牛血清白蛋白，分析纯，购于阿拉丁公司。

1.1.2 仪器与设备

FA100高速万能粉碎机；HH-8数显恒温水浴锅；TG1650-WS离心机；2WAJ阿贝折射仪；HH-6旋转蒸发仪，日本东京理化公司；DHG-9245A鼓风干燥箱；721分光光度计；pHS-25数显pH计；FA2004N电子分析天平。

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理

将葡萄籽原料中的果皮和果肉残渣等杂质尽量除去，漂洗干净，平均分成3组，分别用风干(20.℃)、烘干(50.℃)、冻干(-60.℃)的方法干燥葡萄籽，恒重后用高速万能粉碎机粉碎，过40目筛，-20.℃密封保存备用。

1.2.2 葡萄籽中油脂和蛋白质的提取

水酶法：称取3.00 g葡萄籽，按料液比1∶7加入0.05 mol/L柠檬酸缓冲液，调节pH为6.5，再加入1%复合酶(纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶、胰蛋白酶质量比2∶1∶2∶1)，45.℃酶解7 h，升温至90.℃，灭酶5 min 后冷却至室温。以3 900 r/min的转速离心，吸取上层清油。为提高葡萄籽油的提取量，用冻融法反乳化乳状液，即将酶解液反复冷冻、解冻、离心，直至上层没有油层为止，称量油脂质量，再吸取水层，用考马斯亮蓝G-250法[15]测定蛋白质含量，分别计算葡萄籽油和蛋白质提取量。参照GB 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法测定葡萄籽粗蛋白质含量，计算蛋白质提取率。

索氏提取法：称取3.00 g葡萄籽，放入自制滤纸筒中，脱脂线封口，将滤纸筒放入索氏提取装置内，按料液比1∶8加入石油醚，60.℃水浴提取3 h，结束后将提取液移入旋转蒸发仪内，30.℃减压蒸馏除去溶剂，将旋蒸后的油放入30.℃的鼓风干燥箱中进行烘干，直至恒重，计算葡萄籽油提取量。

1.2.3 葡萄籽油、蛋白质提取量和蛋白质提取率的计算

葡萄籽油提取量=葡萄籽油质量/葡萄籽质量

蛋白质提取量=水相蛋白质含量×水相体积/葡萄籽质量

蛋白质提取率=水相蛋白质含量×水相体积/葡萄籽中粗蛋白质质量×100%

1.2.4 葡萄籽油理化性质的测定

酸值按GB/T 5530—2005方法测定，碘值按GB/T 5532—2008方法测定，过氧化值按GB/T 5538—2005方法测定，皂化值按GB/T 5534—2008方法测定，不皂化物含量按GB/T 5535—2008方法测定，折光指数按GB/T 5527—1985方法测定。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 pH对葡萄籽油和蛋白质提取量的影响

以风干葡萄籽为原料，按1.2.2中水酶法，仅将变量pH设为3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5，其他参数不变，结果见图1。

由图1可知，pH对葡萄籽油和蛋白质提取量有显著影响。葡萄籽油提取量随着pH的升高呈现先增后减的趋势，当pH小于6.5时，随着pH升高，酶活性不断增强，葡萄籽油提取量逐渐增大。当pH为6.5时，葡萄籽油提取量达到最大值(88.56 mg/g)。由此可知，4种酶在pH为6.5时，综合活性最强，对葡萄籽的作用最佳。随着pH继续增大，酶活性减弱，导致葡萄籽油提取量降低。而蛋白质提取量在pH 3.5～7.5的范围内，随着pH升高逐渐增大，当pH达到7.5时，蛋白质提取量达到最大值(79.94 mg/g)；随后pH继续升高，蛋白质提取量反而下降，提取液颜色加深，此时溶液变为强碱性，蛋白质过度水解导致提取量降低。因此，水酶法提取葡萄籽油的最佳pH为6.5，提取葡萄籽中蛋白质的最佳pH为7.5。

注：不同字母代表相同指标间有显著差异(α≤0.05)。下同。

图1pH对葡萄籽油和蛋白质提取量的影响

2.1.2 酶配比对葡萄籽油和蛋白质提取量的影响

以风干葡萄籽为原料，按1.2.2中水酶法，仅将变量酶配比(纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶、胰蛋白酶质量比)设为1∶1∶1∶1、1∶1∶1∶2、1∶1∶1∶3、2∶1∶2∶1、2∶1∶2∶2、2∶1∶2∶3，其他参数不变，结果见图2。

图2 酶配比对葡萄籽油和蛋白质提取量的影响

细胞壁由碳水化合物(纤维素，半纤维素和果胶多糖)和蛋白质构成。纤维素的存在阻止了酶进入蛋白质中，而在长时间的酶解作用下，纤维素酶和果胶酶会使蛋白酶更容易进入到蛋白质中并促进降解[16]。所以根据葡萄籽的结构，利用纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶和蛋白酶的协同作用来提高葡萄籽油和蛋白质提取量。由图2可知，酶配比对葡萄籽油和蛋白质提取量的影响存在显著差异。在不同酶配比中，葡萄籽油提取量较高的3种酶配比为1∶1∶1∶1、2∶1∶2∶1、2∶1∶2∶2。其中在酶配比为2∶1∶2∶1时，葡萄籽油提取量最大，达到88.23 mg/g；而在酶配比为1∶1∶1∶3 时，葡萄籽油的提取量最低，为70.46 mg/g。在复合酶总添加量相同的条件下，纤维素酶和木聚糖酶所占比例越大，葡萄籽油提取量越高，而胰蛋白酶的添加量越多则葡萄籽油提取量越低。在复合酶的作用下，葡萄籽中的蛋白质也同时得到释放。蛋白质提取量较高的3种酶配比是2∶1∶2∶1、2∶1∶2∶2、2∶1∶2∶3，在酶配比2∶1∶2∶2时，蛋白质的提取量最高，达到78.64 mg/g；而在酶配比为1∶1∶1∶1时，蛋白质的提取量最低，为55.51 mg/g。

2.1.3 料液比对葡萄籽油和蛋白质提取量的影响

以风干葡萄籽为原料，按1.2.2中水酶法，仅将变量料液比设为1∶3、1∶5、1∶7、1∶9、1∶11，其他参数不变，结果见图3。

图3 料液比对葡萄籽油和蛋白质提取量的影响

料液比对葡萄籽油和蛋白质的提取量有显著影响。缓冲液可以浸润葡萄籽，使其细胞溶胀，结构受到破坏，则油和蛋白质游离出来，从而提高葡萄籽油和蛋白质的提取量。由图3可知，随着料液比的增加，葡萄籽油和蛋白质的提取量整体呈上升趋势，说明缓冲液越多，提取的葡萄籽油和蛋白质越多。当料液比达到1∶9时，曲线上升幅度明显减小，两者的提取量基本趋于稳定，说明葡萄籽油和蛋白质已经被完全提取，而且料液比过大不利于油水分离。考虑到节约资源和降低成本，最佳料液比选择为1∶9。

2.1.4 酶解时间对葡萄籽油和蛋白质提取量的影响

以风干葡萄籽为原料，按1.2.2中水酶法，仅将变量酶解时间设为3、5、7、9、11 h，其他实验参数不变，结果见图4。

由图4可知，酶解时间对葡萄籽油和蛋白质提取量的影响比较明显。葡萄籽油和蛋白质的提取量随着酶解时间的延长逐渐增大。酶解时间越长，酶与底物作用越充分，反应越彻底，得到的葡萄籽油和蛋白质越多。当酶解时间达9 h时，曲线趋于平稳，说明葡萄籽反应完全。油脂在空气中暴露的时间过长也会影响油脂的品质，所以从油脂的品质和节约成本方面考虑，确定9 h为最佳酶解时间。

图4 酶解时间对葡萄籽油和蛋白质提取量的影响

2.2 水酶法提取葡萄籽油和蛋白质的正交实验优化

在单因素实验的基础上，以葡萄籽油和蛋白质提取量为评价指标，选取酶配比、pH、料液比、酶解时间4个因素进行正交实验优化，每个因素设置3个水平，选用正交实验L9(34)设计，以确定酶解条件的最佳组合。因素水平见表1，正交实验结果及分析见表2，葡萄籽油方差分析见表3，蛋白质方差分析见表4。

由表2可知，各因素对葡萄籽油提取量的影响程度顺序为：A>B>D>C，即酶配比>pH>酶解时间>料液比。最佳因素水平的组合为A2B2C2D2，即酶配比为2∶1∶2∶1、pH 6.5、料液比1∶9、酶解时间9 h，在此条件下葡萄籽油的提取量最高，经3次平行实验验证平均可达到99.47 mg/g。各因素对葡萄籽中蛋白质提取量影响程度顺序为：B>C>A>D，即pH>料液比>酶配比>酶解时间。最佳因素水平的组合为 A3B3C2D2，即酶配比2∶1∶2∶2、pH 7.5、料液比1∶9、酶解时间9 h，在此条件下葡萄籽蛋白质提取量最高，可达到83.26 mg/g，蛋白质提取率达64.05%。因本文以葡萄籽油为主要研究对象，蛋白质为副产物，所以确定葡萄籽油和蛋白质提取的最优条件为酶配比(纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶、胰蛋白酶质量比)2∶1∶2∶1、pH 6.5、料液比1∶9、酶解时间9 h，在此条件下，葡萄籽油和蛋白质的提取量分别为99.47 mg/g和74.86 mg/g，蛋白质提取率为57.58%。由表3和表4可知，酶配比、pH、料液比、酶解时间对葡萄籽油和蛋白质的提取量均有极显著影响。

表1 因素水平

表2 正交实验结果及分析

表3 葡萄籽油的方差分析

注：**代表差异极显著(α≤0.01)。下同。

表4 蛋白质的方差分析

2.3 不同干燥方法对葡萄籽油提取量和理化性质的影响

3种干燥方法得到的葡萄籽按1.2.2中水酶法提取葡萄籽油，不同干燥方法对葡萄籽油提取量和理化性质的影响见表5。

表5 不同干燥方法对葡萄籽油提取量和理化性质的影响

注：不同字母代表相同指标间有显著差异(α≤0.05)。下同。

由表5可知，不同干燥方法对葡萄籽油提取量和理化性质均有显著影响。从提取量上来看，烘干葡萄籽所得葡萄籽油的提取量是最高的，风干次之，冻干明显低于前两者，因为低温处理不利于油脂溶出。从理化性质上来看，烘干酸值最高，冻干最低。可见干燥温度对葡萄籽油的酸值影响较大，原料干燥温度越高，提取的葡萄籽油酸值越大。油脂长时间暴露于空气中会发生酸败，其中游离脂肪酸含量越高，则酸值越大，表明该油脂的品质越差[17]。碘值越低，说明双键减少，油脂氧化的程度越高。3种干燥方法所得葡萄籽油碘值最高的是冻干，其次是风干，烘干显著低于前两者，说明高温促进葡萄籽油氧化，对葡萄籽油中的不饱和脂肪酸有破坏作用。氢过氧化物不稳定，极易分解成小分子化合物，如醛、酮、酸等，因此过氧化值不能反映油脂的氧化程度,只能反映油脂的氧化速度[18]。烘干所得葡萄籽油的氧化速度最快，风干次之，冻干最慢，说明高温能加速油脂的氧化。皂化值越高，说明脂肪酸相对分子质量越小，亲水性越强，易失去油脂的特性；皂化值越低，则脂肪酸相对分子质量越大或含有较多的不皂化物[19]。烘干所得葡萄籽油的皂化值最高，冻干最低，说明高温能产生较多的低相对分子质量的脂肪酸。不皂化物是指油脂中高级脂肪醇、甾醇和碳氢化合物等不能与氢氧化钠或氢氧化钾起皂化反应的物质，其含量越高，油脂的营养价值就越高，3种干燥方法所得葡萄籽油的不皂化物含量均小于等于0.5%。油脂折光指数随其组成中脂肪酸碳数和双键数增加而增大，折光指数较低说明发生氧化，而烘干葡萄籽提取的油的折光指数最低。综上可知，烘干葡萄籽油的提取量虽高，但是由于葡萄籽油中不饱和脂肪酸在高温加热下更容易发生氧化，游离脂肪酸增多导致酸值上升，因而烘干所得葡萄籽油的品质比风干和冻干的相对较差。而冻干葡萄籽油提取量虽低，但冻干使葡萄籽保持在低温真空状态下干燥，尽量避免了葡萄籽油氧化，所以冻干所得葡萄籽油的酸值和过氧化值最低，品质最好。风干的葡萄籽油提取量与烘干相近，而理化性质介于烘干和冻干之间，且风干耗能少、容易操作，适合大规模生产。

2.4 不同提取方法对葡萄籽油提取量和理化性质的影响

以风干葡萄籽为原料，按1.2.2中水酶法和索氏提取法提取葡萄籽油，不同提取方法对葡萄籽油提取量和理化性质的影响见表6。

由表6可知，不同提取方法对葡萄籽油提取量和理化性质的影响显著。传统的索氏提取法获得的葡萄籽油提取量比水酶法高，但提取过程中可能会存在溶剂残留。水酶法提取葡萄籽油的酸值、皂化值和过氧化值明显低于索氏提取法，碘值和折光指数明显比索氏提取法高，这主要是因为水酶法的提取条件比较温和，避免了长时间高温所导致的葡萄籽油氧化，降低了游离脂肪酸的含量。综上，虽然水酶法提取的葡萄籽油提取量明显低于索氏提取法，但水酶法提取葡萄籽油的氧化程度明显低于索氏提取法，所以水酶法提取的葡萄籽油品质更好，而且提取温度较低，更加节约能源。

表6 不同提取方法对葡萄籽油提取量和理化性质的影响

3 结 论

根据单因素和正交实验，水酶法提取葡萄籽油和蛋白质的最佳工艺参数为：纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶、胰蛋白酶质量比2∶1∶2∶1，pH 6.5，料液比 1∶9，酶解时间9 h。在最佳条件下，葡萄籽油提取量达到99.47 mg/g，蛋白质的提取量为74.86 mg/g，蛋白质提取率为57.58%。不同干燥方法对水酶法提取葡萄籽油的提取量和理化性质均有显著影响。从提取量来看，烘干葡萄籽的提取量最高，风干次之，冻干最低。从酸值、碘值、过氧化值、皂化值、折光指数等理化指标来看，以冻干葡萄籽为原料提取的葡萄籽油氧化程度最低，烘干最高，风干居中，说明预处理温度对葡萄籽油的氧化有显著影响。与传统的索氏提取法相比，水酶法提取葡萄籽油的提取量较低，但氧化程度也较低，说明水酶法提取的葡萄籽油品质较优。

水酶法不仅可以提取出优质的葡萄籽油，还能直接得到副产物蛋白质，既节能环保，又得到优质营养资源，但是提取效率不够理想。如果将水酶法和传统方法结合，先用水酶法预处理，再利用溶剂法等传统方法提取，可以最大限度地提取出葡萄籽中的油脂。

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Aqueousenzymaticextractionprocessofoilandproteinfromgrapeseeds

LI Dandan,YANG Hongzhi,LIANG Ying,ZHU Lei

(College of Food Science and Technology,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing 163319,Heilongjiang,China)

TS224.4;TS229

A

1003-7969(2017)09-0028-06

2017-03-14;

2017-05-23

国家自然科学基金青年科学基金项目(3101828)；大庆市指导性科技计划项目(zd-2016-108)；黑龙江八一农垦大学引进人才科研启动计划资助项目(XYB2013-16)

李丹丹(1992)，女，硕士研究生，研究方向为天然产物的活性研究(E-mail)dandan.349382650@hotmail.com。

梁 英，教授，博士(E-mail)liangying-64@163.com；朱 磊，讲师，博士(E-mail)zhulei610@163.com。