奈帕芬胺对角膜组织中前列腺素E2的作用研究*

刘岩，张潇，苏杰

（1.华北理工大学附属医院，河北 唐山 063000；2.华北理工大学，河北 唐山 063210）

奈帕芬胺对角膜组织中前列腺素E2的作用研究*

刘岩1，张潇2，苏杰1

（1.华北理工大学附属医院，河北 唐山 063000；2.华北理工大学，河北 唐山 063210）

目的 通过复制兔眼前节缺血（ASI）模型，检测模型角膜中前列腺素E2（PGE2）的表达，探讨奈帕芬胺在角膜组织中对PGE2的抑制作用。方法 将54只已排除眼疾的健康雄性纯种大耳白兔随机分成对照组（18只兔，36只眼）和手术组（36只兔，72只眼）。手术组36只兔的左眼（36只眼）为缺血组，右眼（36只眼）为治疗组。不同时间在裂隙灯显微镜下观察各组角膜的变化，然后取角膜做病理学检查和免疫组织化学检查，观察各时间PGE2在角膜中的表达。结果 缺血组各时间点PGE2表达增高（P＜0.05），治疗组PGE2表达较缺血组下降（P＜0.05）。结论 在ASI的发病过程中，PGE2发挥重要作用，奈帕芬胺在角膜组织中可有效抑制PGE2。

奈帕芬胺；前列腺素E2；角膜；眼前节缺血

Abstract:Objective To set up a rabbit model of anterior segment ischemia (ASI)with the method of multi-rectus tenotomy,and to investigate the expression of PGE2 in cornea of the model and the effect of Nepafenac on corneal PGE2.Methods Fifty-four purebred health male Japanese White Rabbits without eye diseases were randomly divided into two groups.There were 18 rabbits(36 eyes)in the control group and 36 rabbits(72 eyes)in the operation group which were futher randomly divided into ischemic group(36 left eyes of the 36 rabbits)and treatment group(36 right eyes of the 36 rabbits).The changes of cornea were observed under slit-lamp in different periods in each group.Then the cornea tissue was taken for pathological and immunohistochemical examinations,the expression of PGE2 in cornea tissue was observed at different time.Results At each time point,the expression of PGE2 in the ischemic group increased (P＜0.05),the expression ofPGE2 in the treatmentgroup reduced compared to the ischemia group with statistical significance(P＜0.05).Conclusions PGE2 may play an important role during the onset of ASI.Nepafenac can effectively restrain PGE2 in the corneal tissue.

Keywords:Nepafenac;prostaglandin E2;cornea;anterior segment ischemia

眼前节缺血（anterior segment ischemia，ASI）是斜视矫正术和视网膜脱离术后的严重并发症[1]。前列腺素 E2（prostaglandins E2，PGE2）可引起眼损伤（包括手术后的血管扩张、血管的通透性增加、血-房水屏障瓦解及白细胞趋化等），还能导致炎症、疼痛，增加眼内压及晶状体性黄斑囊样水肿的发生概率等[2]。

奈帕芬胺具有渗透力强、靶向作用强、毒副作用小等优点[3]，近年来为国际眼科界的研究热点。本实验检测兔眼前节缺血模型角膜中PGE2的表达，探讨奈帕芬胺对其的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料

排除眼疾的健康雄性纯种大耳白兔54只（华北理工大学动物中心），体重（2.0±0.2）kg。饲养于华北理工大学动物中心动物房内，温度20～25℃，饲料购自华北理工大学动物中心，喂食4次/d，生长环境相同。

1.2 方法

实验动物随机分成对照组（18只兔，36只眼）和手术组（36只兔）。手术组再分为缺血组36只眼（左眼）和治疗组36只眼（右眼）。对照组36只眼行球结膜360°剪开，未伤及肌肉和血管；手术组72只眼截断4条直肌，烧灼闭塞涡静脉后，将离断的直肌后徙约5 mm，并固定缝合在浅层巩膜上[3-4]，缺血组（左眼）结膜囊内点滴平衡盐溶液1滴/次，4次/d；治疗组（右眼）结膜囊内点滴0.1%奈帕芬胺混悬液1滴/次，4 次 /d。手术后 3 h、6 h、24 h、第 3 天、第 7 天及第14天摘取眼球，大量生理盐水冲洗后固定；12 h后取角膜再固定24 h，做石蜡切片，行苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，免疫组织化学法检测PGE2的表达。

1.3 免疫组织化学法

将包埋好的标本做成与角膜虹膜睫状体矢状轴平行的切片，厚约2.5 μm，放置于预先用APES处理的载玻片上，60℃温箱烤片过夜，二甲苯脱蜡，梯度酒精复水。新鲜配制3%双氧水H2O2，室温10min，以灭活内源性酶，蒸馏水洗2 min/次，共3次。将切片置于0.01 mol/L枸椽酸盐缓冲液（pH 6.0）中，微波炉120 W加温12 min至温度＞95℃，放置10 min后，240 W 加温 4 min，自然冷却，冷却后 PBS（pH 7.2）洗涤1、2次。滴加正常山羊血清，室温10 min，甩去多余液体，不洗。滴加抗PGE2抗体，37℃标记2 h，PBS（pH 7.2）洗2 min/次，共3次。滴加生物素化山羊抗鼠 IgG，37℃孵育，20 min，PBS（pH 7.2）洗 2 min/次，共3次。滴加试剂辣根酶标记链卵白素工作液，37℃孵育，20 min，PBS（pH 7.2）洗 5 min/次，共 4次。DAB显色，显微镜下控制至显色满意后自来水终止显色反应，并充分水洗。苏木素轻度复染，脱水，透明，封片，显微镜下观察。

1.4 术后观察及结果判定

1.4.1 术后角膜观察 用裂隙灯显微镜观察术后角膜改变，记录每日观察结果，并按角膜病变程度进行评分，计分标准[4]：①角膜透明度：角膜清亮计0分；角膜轻度浑浊计1分；角膜浑浊加重，前房仍清晰可见计2分；角膜浑浊继续加重，前房仅模糊可见计3分；角膜全水肿浑浊，前房看不到计4分；②角膜水肿程度：角膜无水肿计0分；角膜轻度基质增厚计1分；角膜出现弥漫性基质水肿计2分；角膜出现弥漫性基质水肿并出现上皮Microcytic水肿计3分；角膜出现大疱性角膜病变计4分；③角膜新生血管：无角膜新生血管计0分；角膜周边可见新生血管计1分；角膜新生血管未达瞳孔区计2分；新生血管达瞳孔区未完全覆盖角膜计3分；全角膜均可见新生血管计4分。总分=角膜透明度评分+角膜水肿程度评分+角膜新生血管评分。

1.4.2 定量分析免疫组织化学法结果 PGE2免疫组织化学法的阳性表达为细胞浆呈现黄色或棕黄色染色。显微镜下弱阳性表现为黄色或微弱的棕黄色，阳性表现为棕黄色，强阳性表现为棕褐色。本研究应用半定量的积分法，在双盲情况下每张切片随机取2个400倍视野，依据染色强度评分：阴性计0分，弱阳性计1分，阳性计2分，强阳性计3分。阳性细胞比例则用1个视野内的阳性染色细胞数占细胞总数的百分比来表示：1%～10%计1分，11%～50%计2分，51%～80%计3分，＜80%计4分。免疫组织化学法评分=染色强度×阳性细胞比例。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 13.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，用重复测量设计的方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 术后角膜改变

裂隙灯显微镜下观察，对照组角膜未见明显改变。缺血组术后3 h角膜未见水肿；术后6 h开始出现轻度水肿浑浊但前房清晰可见；术后24 h水肿程度加重，基质层轻度增厚，前房仍可见；术后第3天水肿程度明显加重，出现弥漫性的基质水肿，前房开始模糊但仍可见（见图1）；术后第7天水肿严重，表现为角膜全部呈现白色浑浊，前房已观察不到，Microcytic水肿大量出现，甚至出现疱性角膜变性5例，新生血管3例（见图2）。术后第14天与第7天比较，水肿减轻，在裂隙灯下可观察到前房，2例水肿完全消退，其余仍残余基质水肿，角膜大疱消失，6例可观察到角膜缘出现新生血管。

与缺血组比较，治疗组在3、6和24 h区别不明显，术后第3天表现为角膜轻度浑浊，前房清晰可见；术后第7天角膜浑浊但前房模糊可见，未观察到角膜大疱，可观察到角膜缘的新生血管2例；术后第14天角膜恢复透明，前房均清晰可见。1例角膜缘可见新生血管。

2.2 缺血组与治疗组角膜病变评分比较

缺血组与治疗组术后 3 h、6 h、24 h、3 d、7 d 和14d的角膜评分比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间的角膜病变评分有差异（F=18.557，P=0.007）；②缺血组与治疗组的角膜病变评分有差异（F=34.362，P=0.001），治疗组比缺血组角膜评分低，相对角膜病变较轻；③缺血组与治疗组的角膜病变评分变化趋势有差异（F=14.372，P=0.000）。见表1和图3。

图1 缺血组第3天

2.3 病理结果

2.3.1 HE染色 对照组角膜上皮细胞呈立方形，排列整齐，基质层纤维排列整齐（见图4）。缺血组术后3 h角膜无明显变化；术后6 h角膜上皮细胞仍排列整齐，未见水肿，但基质层排列轻度疏松；术后24 h角膜上皮细胞排列出现紊乱，角膜缘基质排列更加疏松；术后第3天出现角膜上皮细胞肿胀，基质内有炎症细胞浸润；术后第7天角膜内皮细胞肿胀更加严重，部分脱落，基质层炎症细胞增多，以淋巴细胞为主，可见红细胞游出，3例角膜缘出现细小的新生血管（见图5）；术后第14天角膜缘浅层角膜存在大量的炎症细胞，仍以淋巴细胞为主，可见红细胞，6例角膜缘出现细小的新生血管。

2.3.2 病理改变 与缺血组比较，治疗组各时间角膜的病理改变明显减轻。治疗组术后3、6和24 h角膜基本正常。术后第3天角膜上皮开始水肿，但细胞排列较规整。术后第7天角膜上皮细胞轻度水肿，可见少量炎症细胞渗出，以淋巴细胞为主。1例角膜缘出现细小的新生血管（见图6）。术后第14天角膜基本恢复正常，1例角膜缘出现细小的新生血管。

图2 缺血组第7天

表1 两组角膜病变评分比较 （n=36，分，±s）

表1 两组角膜病变评分比较 （n=36，分，±s）

组别 3 h 6 h 24 h 3 d 7 d 14 d缺血组 0.33±0.52 1.72±0.52 2.67±0.51 4.60±0.55 8.40±0.82 3.67±1.04治疗组 0.20±0.45 1.05±0.45 1.73±0.55 2.54±0.84 6.60±0.89 1.40±0.87

图3 两组角膜病变评分变化

图4 对照组角膜 （HE×400）

图5 缺血组第7天角膜 （HE×400）

2.4 PG E2的免疫组织化学法结果

对照组仅角膜基质细胞可见PGE2弱阳性表达（见图 7）。

缺血组术后3 h，在角膜基质可见PGE2弱阳性表达，角膜上皮细胞层基底细胞处可见PGE2弱阳性表达；6和24 h角膜基质PGE2表达增强，角膜上皮细胞层基底细胞处可见PGE2弱阳性表达，同时表层细胞出现弱阳性表达；第3天开始细胞PGE2表达升高；第7天上皮细胞、基质细胞中PGE2变现为强阳性表达，阳性细胞数增多，呈棕褐色强着色，阳性血管数增加（见图8）；第14天PGE2的染色强度下降。

治疗组在4条直肌离断后，给予奈帕芬胺进行干预，角膜PGE2表达强度变化趋势与对照组相似，但治疗组角膜PGE2表达明显减弱（见图9）。

2.5 3组角膜的PG E2免疫组织化学法评分比较

图6 治疗组第7天角膜 （HE×400）

图7 对照组角膜PG E2的表达 （HE×400）

缺血组、治疗组与对照组术后 3 h、6 h、24 h、3 d、7 d和14 d的PGE2免疫组织化学法评分比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间的PGE2免疫组织化学法评分有差异（F=12.970，P=0.002）；②缺血组、治疗组与对照组的PGE2免疫组织化学法评分有差异（F=17.572，P=0.000），缺血组、治疗组PGE2免疫组织化学法评分较对照组高，治疗组PGE2免疫组织化学法评分较缺血组低；③缺血组、治疗组与对照组的角膜PGE2免疫组织化学法评分变化趋势有差异（F=10.190，P=0.000）。见表2和图10。

图8 缺血组第7天角膜PG E2的表达 （HE×400）

图9 治疗组第7天角膜PG E2的表达 （HE×400）

图10 3组角膜PG E2免疫组织化学法评分变化

表2 3组角膜PG E2免疫组织化学法评分比较 （n=36，分，±s）

表2 3组角膜PG E2免疫组织化学法评分比较 （n=36，分，±s）

组别 3 h 6 h 24 h 3 d 7 d 14 d对照组 2.47±0.52 3.28±0.69 3.85±0.56 4.59±0.83 5.21±0.74 3.07±0.87缺血组 10.96±0.58 16.23±0.89 28.96±1.07 49.27±1.52 72.79±1.84 36.39±1.55治疗组 5.52±0.95 7.62±0.73 10.20±0.78 20.27±0.69 35.23±1.27 12.09±0.67

3 讨论

眼前节缺血综合征是潜在的致盲因素之一，可以表现为全身性疾病中眼部的损害，也可以表现为某些眼部疾病的直接反应。当其表现为眼部手术并发症时，则更具有临床意义[5]。本综合征临床表现为从角膜到眼内各结构的损害，这是眼部各个结构出现非特异性组织水肿，继而出现渗出甚至出血等改变的结果。

目前，国内外对于眼前节缺血的发生机制，仍未明确，大部分人推测该病发生、发展的过程为低灌注压引起组织缺氧，继而导致细胞坏死，再引发眼内的炎症反应。本实验在裂隙灯显微镜下观察角膜，对照组除结膜充血、水肿外，未发现角膜水肿浑浊；而缺血组和治疗组发生明显角膜水肿且角膜病变评分高于对照组。推测眼前节缺血后出现以上病理变化的原因是眼的血-房水屏障被破坏。该屏障为上皮型屏障，主要位于眼内睫状体的上皮细胞。一旦该屏障被破坏，即引起毛细血管内皮细胞间的连接被打开，内皮细胞间缝隙加大，从而导致血管腔内的大分子渗漏出来，使房水的成分受到明显影响，继而导致角膜出现水肿等病变。

在对角膜PGE2表达强度进行组间同一时间及组内不同时间分析时发现，缺血组和治疗组表现为各相邻时间有差异，PGE2的表达从术后3 h即开始升高，到术后第7天达峰值，术后第14天又较前下降。由此推测由于眼前节组织血液供应障碍，组织内低灌注引起缺血缺氧，PGE2表达上调，导致眼内炎症。据此提示PGE2在眼前节缺血的发病中发挥作用，寻找能有效抑制PGE2的药物可能成为治疗眼前节缺血的方法之一。

奈帕芬胺是眼科新研发的非甾体类解热镇痛抗炎药。奈帕芬胺不仅渗透力、靶向作用较传统非甾体类解热镇痛抗炎药强，而且毒副作用较其明显减小[6]，近年来已经成为国际眼科用药的研究热点，主要用于白内障术后疼痛和炎症的治疗。奈帕芬胺极性较小，离子影响相关的角膜上皮吸收减少[3]，增加期对特定组织的渗透性[10-12]。实验表明，期能够比溴芬酸和酮咯酸更迅速地渗透过兔离体角膜组织[10，12]，并分散到房水、虹膜、睫状体、视网膜及脉络膜中[1]。而奈帕芬胺在角膜内的生物转化是可以忽略不计的[12]，这使其在角膜的毒性最小。奈帕芬胺是仅有的能生物转化为氨芬酸的物质。氨芬酸是一种芳基乙酸衍生物，通过抑制前列腺素H合成酶（环氧化酶-2），阻断前列腺素的合成，来发挥抗炎止痛的作用。体外对奈帕芬胺、氨芬酸、吡铬酸及溴芬酸的药效学研究显示，氨芬酸对环氧化酶-2的抑制活性最强[7]。而奈帕芬胺可通过抑制环氧化酶-2，抑制血管内皮生长因子，从而抑制新生血管生成[13]。应用于糖尿病视网膜病变的奈帕芬胺滴眼液正在爱尔康公司进行Ⅲ期临床试验[14]。目前其在眼前节缺血治疗方面尚无报道。本实验在兔眼球结膜囊内点滴0.1%奈帕芬胺混悬液进行治疗。在观察结果时发现，当对照组、缺血组及治疗组在各时间进行比较时，缺血组、治疗组的角膜病变评分和角膜PGE2免疫组织化学法评分高于对照组，而治疗组角膜病变评分和PGE2免疫组织化学法评分低于缺血组。结果证实，在眼前节缺血的发病过程中，通过结膜囊内点滴奈帕芬胺即可明显抑制角膜组织中PGE2的含量，改善角膜水肿症状，抑制角膜新生血管。说明奈帕芬胺可有效穿透角膜，抑制PGE2的作用，及时控制炎症反应，抑制角膜新生血管，取得满意的效果。

有研究表明，局部应用奈帕芬胺15 min即可起效，且作用持续≥8 h[7]。本实验结果证实，治疗组术后3 h奈帕芬胺即开始显效，3 d作用显著，7 d效果达高峰，14 d治疗仍有效。奈帕芬胺抑制PGE2的作用机制为其可以在眼内水解酶的作用下转换成更具有活性的氨芬酸[8]。氨芬酸是一种芳基乙酸衍生物，通过抑制前列腺素H合成酶来阻断前列腺素的合成，以发挥抗炎止痛的作用。

总之，结膜囊内点滴奈帕芬胺治疗对保护眼前节缺血时角膜组织的形态和功能起到重要的作用。

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（童颖丹 编辑）

Effect of Nepafenac on prostaglandin E2 in corneal tissue*

Yan Liu1,Xiao Zhang2,Jie Su1
(1.The Affiliated Hospital,North China University of Science and Technology,Tangshan,Hebei 063000,China;2.North China University of Science and Technology,Tangshan,Hebei 063210,China)

R772.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.23.002

1005-8982（2017）23-0007-06

2016-12-01

河北省卫计委课题（No：20170198）；河北省唐山市科技局课题（No：13130292z）；华北理工大学教改课题（No：z1516-07）