液相色谱-串联质谱法同时检测乙醛-DNA加合物

刘鲁娟， 李翔宇， 陈 欢， 侯宏卫*， 胡清源*

(国家烟草质量监督检验中心，河南郑州 450001)

乙醛在参比卷烟2R1F中含量为1 110～2 101 微克/支烟[1]，是卷烟烟气中最主要的致癌物之一，且在大鼠体内乙醛是内分泌系统和神经元对尼古丁反应的增强剂，表现为协同效应[2]，世界卫生组织(WHO)烟草控制框架公约(FCTC)将其列为烟气优先管制污染物[3]。同时，人体可以通过代谢乙醇以及脂质的过氧化产生内源性的乙醛[4 - 5]。大量研究表明乙醛具有遗传毒性[6]，国际癌症研究机构(IARC)将其列为2B类致癌物(IARC,2012)[7]。

乙醛可以与脱氧鸟苷反应形成N2-亚乙基-2′-脱氧鸟苷(Ethylidene-dG)和一对非对映异构体(6S,8S)和(6R,8R)-1,N2-丙醇-2′-脱氧鸟苷(Propano-dG)[8 - 10](图1)。其中，Ethylidene-dG在单核苷酸状态下不稳定，需要还原为N2-乙基-2′-脱氧鸟苷(Et-dG)才能被检出。因此，准确测定DNA中的乙醛-DNA加合物，对于评估DNA受到的损伤程度及可能的致癌风险具有重要意义。

图1 乙醛-DNA加合物的结构式Fig.1 Chemical structures of acetaldehyde-DNA adducts

Fang等[11]利用32P-后标记技术首次检测出体外乙醛暴露小牛胸腺DNA产生的乙醛-DNA加合物为N2-乙基-2′-脱氧鸟苷，该方法的灵敏度较高，但不能提供加合物的结构信息，且标记效率不确定，重现性差[12]。李木兰[13]利用紫外光谱移动法检测出乙醛暴露小牛胸腺DNA后256 nm处的吸收峰向长波方向移动，可初步判断乙醛能够加合到DNA中的亲核位点，但该方法灵敏度和专一性较低。Singh等[9]利用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)检测出饮酒之后人体白细胞中的N2-乙基-2′-脱氧鸟苷；Li等[14]采用LC-MS/MS方法检测出人体白细胞中N2-乙基-2′-脱氧鸟苷的含量在吸烟者戒烟前后存在显著差异(戒烟之后下降了28%，P=0.02)。该方法选择性好、灵敏度高且使用同位素作为内标可以对加合物进行准确定量和结构分析等优势，成为了检测DNA加合物的理想技术[15 - 16]。本研究基于LC-MS/MS技术，建立了一种同时检测DNA中Ethylidenet-dG和Propano-dG的方法，该方法具有灵敏度高、分析时间短、特异性强等特点。以体外小牛胸腺DNA为模型，优化了L-精氨酸的用量并探讨了乙醛-DNA加合物的含量与乙醛染毒剂量和染毒时间之间的关系，检测外源性乙醛暴露所产生的DNA加合物，为乙醛暴露的风险评价提供依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

AB SCIEX三重四极杆串联质谱仪(美国，加州应用生物系统公司)；Agilent 1200高效液相色谱(美国，安捷伦公司)；NanoDrop 2000超微量分光光度计(美国，赛默飞科技公司)；恒温培养箱(美国，赛默飞科技公司)；Strata-X聚合物小柱(33 μm,30 mg/1mL，广东菲罗门科学仪器有限公司)；Milli-Q水纯化系统(德国，默克集团)；Analyst 1.5.1数据采集与处理软件。

脱氧核糖核酸酶Ⅰ、碱性磷酸酶(美国纽英伦生物技术公司)，磷酸二酯酶Ⅰ、乙醛溶液(99.0%)和小牛胸腺DNA(美国西格玛公司)，甲醇(韩国德山试剂公司)，NaBH3CN、L-精氨酸(上海阿拉丁试剂公司)，标准品Et-dG、Propano-dG和内标物[15N5]Et-dG、[15N5]Propano-dG(上海有机所合成，纯度分别为99.7%、99.97%、99.6%和99.8%)，试剂均为色谱纯。实验用水为超纯水。

1.2 标准溶液的配制

准确称取2 mg Et-dG、Propano-dG、[15N5]Et-dG和[15N5]Propano-dG，用甲醇配制成0.2 mg/mL的标准储备液，存于棕色试剂瓶中，于冰箱中-20 ℃贮存。

1.3 乙醛暴露小牛胸腺DNA

取400 μg小牛胸腺DNA，加入1 mL不同浓度(0.001、0.01、0.05、0.1、0.5和1.0 mmol/L)的乙醛溶液，乙醛溶液用0.01 mol/L的磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH=7.4)配制，对照组加入同等体积的PBS。上述溶液中各加入8.0 mg的L-精氨酸，放入37 ℃恒温培养箱中24 h；用2倍体积的冰乙醇沉淀DNA并终止反应，12 000×g离心5 min，去掉上清，用70%的乙醇水清洗DNA样品，得到的DNA团块晾干并加入200 μL超纯水复溶，用NanoDrop 2000超微量分光光度计在波长260 nm处检测DNA的含量(对于双链DNA一个吸收单位OD相当于50 μg/mL)。不同时间梯度暴露选用1.0 mmol/L乙醛溶液分别暴露0、2、4、10、12、20和24 h。

1.4 样品前处理

将DNA溶于600 μL的10 mmol/L Tris-HCl/2.5 mmol/L MgCl2溶液/5 mmol/L CaCl2缓冲溶液(pH=7.0)中，加入20 μL浓度为100 ng/mL的[15N5]Et-dG和[15N5]Propano-dG混合内标。向上述溶液中加入30 mg的NaBH3CN和60单位(U)脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNaseⅠ)，在37 ℃水浴中孵育2 h，随后加入0.008 U磷酸二酯酶Ⅰ(PI)和30 U碱性磷酸酶(CIP)，在37 ℃水浴中继续孵育2 h，将DNA水解为单核苷酸状态。水解液上样至用1 mL甲醇活化、1 mL水平衡后的 Strata-X聚合物固相萃取(SPE)小柱，然后使用1 mL水和1 mL 10%的甲醇水溶液淋洗，最后用1 mL 50%的甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液，过0.22 μm有机相尼龙滤膜，滤液进行LC-MS/MS分析。

1.5 色谱质谱条件

色谱条件：Thermo AcclaimTMPolar AdvantageⅡC18色谱柱(150×4.6 mm，3.0 μm)，柱温30 ℃；流动相A：甲醇，流动相B：超纯水；等度洗脱条件：0～15 min：35%A，流速为0.40 mL/min，进样量为5 μL。

质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，多反应监测模式(MRM)，正离子模式扫描；喷雾电压：5 500 V，离子源温度：550 ℃，气帘气：20 psi，雾化气(Gas1)：70 psi，干燥气(Gas2)：75 psi，碰撞气：9 psi，入口电压：10 V，出口电压：10 V。整个分析过程由Analyst 1.5.1软件控制。

2 结果与讨论

2.1 L-精氨酸用量的选择

研究表明，氨基酸类物质的存在可以加速乙醛与脱氧鸟苷的反应，进而产生Propano-dG加合物[17 - 18]。在体外条件下，实验选用1.0 mmol/L乙醛暴露小牛胸腺DNA，控制同样的反应条件，实验组加入精氨酸(对照组不加)，结果表明体外1.0 mmol/L乙醛暴露条件下加合物Propano-dG在精氨酸的催化作用下才能生成(图2)，原因可能是碱性氨基酸首先与乙醛反应生成希夫碱，然后与另一分子的乙醛发生迈克尔加成产生2-丁烯基亚胺，最后与脱氧鸟苷上的碱基发生迈克尔加成-关环反应，水解脱去氨基即为Propano-dG加合物。实验优化了L-精氨酸的用量，体外1.0 mmol/L乙醛暴露条件下设置精氨酸用量2、4、6、8和10 mg，分别检测Et-dG和Propano-dG的含量，结果显示随着精氨酸用量的增加，加合物Et-dG和Propano-dG的含量也随之增加，而当精氨酸用量大于8 mg时，Et-dG的含量有所下降，故L-精氨酸的用量选择8 mg(图3)。

图2 加合物Propano-dG的色谱图Fig.2 Chromatograms of Propano-dG adducts(a) exposed to 1.0 mmol/L acetaldehyde at 37 ℃ for 24 h;(b) exposed to 1.0 mmol/L acetaldehyde and 8 mg arginine at 37 ℃ for 24 h;(c) chromatogram of stable isotope internal standard.

图3 不同精氨酸用量对乙醛-DNA加合物Et-dG(a)和Propano-dG(b)含量的影响Fig.3 Effect of different levels of arginine on the content of acetaldehyde-DNA adducts Et-dG(a) and Propano-dG(b)

2.2 色谱柱的选择

由加合物Propano-dG的结构可知，其存在两个非对映异构体，在色谱图上表现为两个色谱峰。为了获得较好的分离度，对两种不同的C18色谱柱：Thermo AcclaimTMPolar AdvantageⅡC18(150×4.6 mm，3.0 μm)和Extend-C18(100×4.6 mm,1.8 μm)进行了考察。结果可见，Extend-C18柱中Et-dG与Propano-dG的一个同分异构体出现了共洗脱现象，因此选择Thermo AcclaimTMPolar AdvantageⅡC18色谱柱(150×4.6 mm，3.0 μm)作为分析柱。

2.3 质谱条件的选择

用蠕动泵以10 μL/min的流速连续注射，分别将500 ng/mL的Et-dG、Propano-dG、[15N5]Et-dG和[15N5]Propano-dG标准溶液注入ESI离子源中，首先在正离子模式下进行一级质谱扫描，得到相应的准分子离子峰[M+H]+，然后对该准分子离子峰进行子离子扫描得到碎片离子。选取丰度较高、干扰较小的为定量离子对，为了达到更高的灵敏度，对去簇电压(CE)和碰撞能量(DP)等参数进行了优化。分析物及内标的MRM参数见表1。

表1 多反应监测模式下分析物及其内标的参数

*The ion for quantification.

2.4 标准曲线和线性范围

准确移取Et-dG和Propano-dG的标准储备液，其浓度梯度为0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 ng/mL，内标[15N5]Et-dG和[15N5]Propano-dG浓度为2 ng/mL，用HPLC-MS/MS法进行测定，每个样品进样3次，以信噪比(S/N)为3确定检出限。以目标物的色谱峰面积与内标峰面积之比(y)对其浓度之比(x)进行线性回归分析，结果显示两种目标物都具有良好的线性关系。目标物的标准曲线和检出限(LOD)及定量限(LOQ，S/N=10)见表2。

表2 Et-dG和Propano-dG的标准工作曲线及LOD和LOQ

2.5 精密度和稳定性

用三个质控(Quality Control,QC)样本，低(0.2 ng/mL)、中(2.0 ng/mL)、高浓度(2.0 ng/mL)在同一天内平行测定6次得到日内精密度，然后再连续三天分别检测得到日间精密度，日内精密度和日间精密度均小于6%。稳定性试验考察的内容包括短期稳定性、冻融稳定性及长期稳定性。该方案中所考察的短期稳定性考察3组高、中、低QC样品在48 h(n=6)内的稳定性，冻融稳定性包括3组高、中、低质控样品分别在3次冻融循环后的稳定性。长期稳定性考察3组高、中、低质控QC样品在30 d内的稳定性(-80 ℃，n=6)。结果显示RSD均小于等于10%，结果见表3。

表3 Et-dG和Propano-dG的精密度和稳定性

2.6 回收率试验

采用空白样品基质加标准品的方法测定方法的回收率，用小牛胸腺DNA作为样本，在酶水解步骤，选取三个添加水平(0.2、1.0、2.0 ng/mL)加入标准品，每个实验平行做三次，两种目标物的回收率在96.0%～101.6%之间，相对标准偏差在1.4%～6.6%之间，证明该方法满足方法学要求。

2.7 乙醛-DNA加合物与乙醛暴露的效应关系

对乙醛水溶液暴露DNA中Et-dG和Propano-dG进行检测分析，根据目标物与其稳定同位素内标物的保留时间基本保持一致的原理，并结合所选择分析离子对对目标物进行定性分析。根据目标物及其内标物阴影面积的比值进行定量分析，依据标准曲线计算获得各个样品中DNA加合物的浓度，根据公式：

(1)

计算获得样品中DNA加合物相对于核苷酸的含量，结果乘以108换算成DNA加合物个数(108个核苷酸)。

将不同乙醛暴露剂量和不同乙醛暴露时间下Et-dG和Propano-dG的含量使用SPSS数据统计软件(19.0版本)进行统计分析。结果显示在L-精氨酸的催化作用下，Et-dG和Propano-dG的量随着乙醛染毒剂量和染毒时间的增加而增加，呈现剂量-效应和时间-效应关系(P<0.003，图4)，且基本呈线性增长关系。在DNA分子水平进行的乙醛暴露实验进一步验证了在氨基酸类物质存在的条件下乙醛与DNA的反应活性，乙醛和脱氧鸟苷加合物的定量检测可用于含乙醛类污染物暴露所致的DNA损伤性研究。

图4 不同乙醛暴露剂量下(37 ℃，24 h)小牛胸腺DNA中Et-dG(a)和Propano-dG(b)含量；不同染毒时间下(37 ℃，1.0 mmol/L)小牛胸腺DNA中Et-dG(c)和Propano-dG(d)的含量Fig.4 Effect of acetaldehyde exposure dose on Et-dG(a) and Propano-dG(b) formation in calf thymus DNA(Reaction condition:37 ℃,24 h);Effect of acetaldehyde exposure time on Et-dG(c) and Propano-dG(d)(Reaction condition:37 ℃,1.0 mmol/L)

3 结论

本工作建立了一种灵敏度高、分析时间短、选择性好且可以同时检测DNA中的Et-dG和Propano-dG的LC-MS/MS方法。利用此方法检测了不同浓度和不同时间乙醛暴露条件下小牛胸腺DNA中Et-dG和Propano-dG的量，结果显示Et-dG和Propano-dG的量与乙醛暴露剂量成剂量-效应关系和暴露时间成时间-效应关系。本研究从DNA分子水平上验证了乙醛在氨基酸类物质存在条件下的反应活性，乙醛中活泼的醛基不需要机体的代谢即可直接进攻亲核物质DNA，适用于含乙醛类污染物对DNA分子暴露后Et-dG和Propano-dG加合物的生物监测。