miR—21在心肺复苏后大鼠血浆中的表达意义

何爱文　王东升　张倩倩

[摘要] 目的 探討微小RNA-21（miR-21）在心肺复苏（cardiopulmonary resuscitation，CPR）后大鼠血浆中的表达差异及其意义。 方法 SD大鼠随机分成假手术对照组（对照组）和心肺复苏组（CPR组），每组16只。采用窒息法建立大鼠心肺复苏模型，测定大鼠气管切开后（对照组）或心肺复苏后（CPR组）24 h的心率（HR）、左室收缩末压（LVESP）、左室舒张末压（LVEDP）、左室内压的最大上升和下降速率（±dp/dtmax）等血流动力学指标。两组于气管切开后（对照组）或心肺复苏后（CPR组）24 h取全血，离心取血浆，提取总miRNA，用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法检测血浆miR-21含量并分析血浆miR-21在两组中表达的差异。测定CK、CK-MB和cTnI，并分析血浆miR-21与上述指标的相关性。采用计算受试者工作特征（ROC）曲线下面积（AUC）评估miR-21、CK、CK-MB及cTnI诊断CPR后心功能障碍的效能。 结果 与对照组比较，CPR组大鼠HR、LVSEP、LVEDP、±dp/dtmax及血浆miR-21、CK、CK-MB、cTnI表达差异具有统计学意义（P<0.01）。相关分析表明，CPR后大鼠血浆miR-21的表达量与CK、CK-MB、cTnI和LVEDP呈正相关性，与HR、LVSEP和±dp/dtmax呈负相关（P<0.01）。血浆miR-21、CK、CK-MB和cTnI的曲线下面积分别为0.859、0.719、0.803、1.000。 结论 miR-21可能参与了CPR后心功能障碍，血浆miR-21可能是CPR后心肌损伤潜在的诊断学标志物。

[关键词] 心搏骤停；心肺复苏；心功能障碍；微小RNA-21；qRT-PCR

[中图分类号] R459.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）24-0037-04

[Abstract] Objective To investigate the difference of microRNA-21（miR-21）expression in rat plasma after cardiopulmonary resuscitation（CPR） and its significance. Methods SD rats were randomly divided into sham operation control group（control group）and cardiopulmonary resuscitation group（CPR group）， with 16 rats in each group. The model of cardiopulmonary resuscitation in rats was established by using smothering method. Hemodynamic parameters were measured after tracheotomy（control group） or after cardiopulmonary resuscitation（CPR group）， such as heart rate（HR）， left ventricular end-systolic pressure （LVESP）， left ventricular end-diastolic blood pressure（LVESP）， maximum rise and fall rate of left ventricular pressure （±dp/dtmax） and other hemodynamic parameters. Whole blood was collected 24 h after tracheotomy （control group） or cardiopulmonary resuscitation（CPR group）in both group， the plasma was collected after centrifuge， and total miRNA was extracted. The plasma miR-21 content was measured by real-time fluorescence quantitative PCR（qRT-PCR）and the difference of plasma miR-21 expressions between the two groups was analyzed. CK， CK-MB and cTnI were measured and the correlation between plasma miR-21 and the above indexes were analyzed. The efficacy of miR-21， CK， CK-MB and cTnI in the diagnosis of cardiac dysfunction after CPR was assessed by calculating the area under the ROC curve（AUC）. Results Compared with the control group， the differences of expressions of HR， LVSEP， LVEDP， ± dp/dtmax and plasma miR-21， CK， CK-MB and cTnI in CPR group were statistically significant（P<0.01）. Correlation analysis showed that the expression volume of miR-21 in rat plasma after CPR was positively correlated with CK， CK-MB， cTnI and LVEDP， and negatively correlated with HR， LVSEP and ± dp/dtmax（P<0.01）. The area under the curves of plasma miR-21， CK， CK-MB and cTnI were 0.859， 0.719， 0.803 and 1.000 respectively. Conclusion miR-21 may be involved in cardiac dysfunction after CPR. Plasma miR-21 may be a potential diagnostic marker for myocardial injury after CPR.endprint

[Key words] Cardiac arrest； Cardiopulmonary resuscitation； Cardiac dysfunction； MicroRNA-21； qRT-PCR

心搏骤停（cardiac arrest，CA）作为最严重的全身性缺血缺氧损伤，严重威胁人类健康。随着“生命之门”之现代CPR术50余年的发展与推广，越来越多的CA患者得到及时救治并恢复自主循环（recovery of spontaneous circulation，ROSC），但仍有约30%的患者在ROSC后24 h内死亡，CPR后心功能障碍是患者复苏后早期死亡的主要原因之一[1]。目前尚缺乏早期、准确、敏感的预警指标评估CPR后心功能障碍，目前主要参照的是冠心病相关的生物学标志物，其存在一定的局限性，因此需要寻找新的生物标志物，为临床上对CPR后心功能障碍的早期诊断、治疗和预后判断提供依据[2]。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是内源性的非编码微小RNA，通过完全或不完全性配对方式与互补mRNA结合，从而降解靶mRNA或抑制其转录后翻译，可调控30%以上的人类基因表达[3]。2008年Mitchell PS等[4]在研究前列腺癌时首次报道了血浆miRNA，研究发现miRNA在血清或血浆中可以稳定地存在，其不受内源性核糖核酸酶（RNase）活性的影响，使得miRNA有望成为疾病的生物学标志物。研究已发现[5]，血浆miR-21在冠心病患者中表达明显升高，提示其可能参与了心肌梗死后心肌损伤过程，是急性心肌梗死潜在的诊断学标志物。但目前尚未见有关于CPR后血浆miR-21表达情况的文献报道。因此，本实验采用窒息法建立大鼠CA/CPR模型，检测大鼠CPR后血浆miR-21的表达变化，并探讨血浆miR-21在心肺复苏后心肌损伤中的意义，为CPR后心功能障碍的诊断与预警方面提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取2015年7月～2016年1月间成年雄性SD大鼠32只，体重320～400 g，购自中国科学院上海实验动物中心（实验动物许可证号：SCXK（沪）2015-0007），由温州医科大学实验动物中心负责饲养。

1.2 实验仪器与试剂

ABI7500实时荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司）；梯度PCR仪、凝胶成像仪（美国BIO-RAD公司）；UV751GD紫外/可见分光光度计（美国Beckman Coulter公司）；Univerval-32R低温高速离心机（德国Hettich公司）；7600生化仪（上海申能生物技术有限公司）；Access免疫化学发光分析仪（美国Beckman公司）；MedLab-U/4CS生物信号采集处理系统（南京美易科技有限公司）；HX-300动物呼吸机（成都泰盟科技有限公司）。miRcute miRNA Isolation Kit（天根生化科技北京有限公司），Trizol LS Reagent（美国Invitrogen公司），Bulge-Loop miRNATM qRT-PCR Prime（广州锐博生物科技有限公司），SYBR Green Realtime PCR Master Mix（东洋纺上海生物科技有限公司）。

1.3 实验分组及心肺复苏模型建立

根据研究目的按随机数字表法分成假手术对照组（对照组）、心肺复苏组（CPR组），每组16只大鼠，术前12 h禁食但不禁水。模型建立：（1）对照组：大鼠仅进行注射5%水合氯醛液腹腔注射麻醉和气管插管、血管穿刺，不窒息不复苏。（2）CPR组：基本操作同对照组，采用经典窒息法建立大鼠CPR模型[6]，大鼠在心脏停搏后3 min开始CPR（胸外心脏按压+肾上腺素+呼吸机辅助通气）。当大鼠恢复ROSC并维持24 h纳入CPR组。参照Utstein标准[7]，当心电图呈室颤、停搏或无脉性电活动，收缩压≤25 mmHg时提示心搏骤停；当心电图恢复自主节律，收缩压>60 mmHg，并持续10 min以上时提示ROSC。

1.4 实验步骤

1.4.1 大鼠心脏血流动力学监测 两组大鼠均常规颈动脉穿刺置管，然后接换能器及多导生理检测仪，再连接MedLab-U/4CS生物信号采集处理系统，直接测定并记录所有大鼠24 h时相的血流动力学指标，包括HR、LVESP、LVEDP、±dp/dtmax。

1.4.2 血浆总RNA的提取及质量检测 按照miRcute miRNA Isolation Kit试剂盒的说明书提取血浆中的总RNA；采用NanoDrop ND-1000检测RNA的浓度和纯度；琼脂糖凝胶电泳法进一步检测总RNA的质量。实时荧光定量PCR：参照大量的文献报道和我们前期所取得的一系列实验研究基础。实验需要的逆转录引物由广州锐博生物科技有限公司提供，本实验中所采用的内参对照由廣州锐博生物科技公司提供的miRNA qRT-PCR Standard RNA作为标准品基因（cel-miR-39）外源加入血浆中作为内参。RT反应参数：42℃ 60 min，70℃ 5 min。Real-Time PCR 反应参数：95℃ 3 min，95℃ 5sec，62℃ 35sec（40个循环）。本实验采用ABI7500荧光定量PCR仪进行检测，每个反应做3个复孔，记录每个孔中信号到达设定阈值时的循环数，即Ct值，计算3个孔Ct值的平均值作为最终结果。miRNA表达水平的计算方法：以cel-miR-39作为内参照，计算miR-21相对表达值RQ（RQ=2-△Ct），△Ct=Ct miR-21-Ct cel-miR-39。

1.4.3 血清CK、CK-MB和cTnI测定 采用生化仪免疫抑制法测定血清CK、CK-MB含量，Access免疫化学发光分析仪及其配套试剂测定血清cTnI含量，同时测定红细胞压积（HCT）值校正0.9%氯化钠溶液稀释的影响。endprint

1.5 统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件进行统计分析，计量资料均采用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，相关性评估采用Spearman相关分析，效能评估采用ROC曲线，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠实验基础参数

对照组和CPR组（CA前）大鼠体质量、心率、MAP基础值、水合氯醛使用量比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2 两组大鼠血浆miR-21表达水平变化

对照组miR-21相对表达量（2-△Ct）为（0.20575±0.06939），CPR组miR-21相对表达量（2-△Ct）为（0.57037±0.17243），两者比较差异有统计学意义（t=7.847，P<0.01）。

2.3 两组大鼠血流动力学变化及miR-21与HR、LVESP、LVEDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax的相关性

两组大鼠于气管切开后或心肺复苏后24 h血流动力学指标HR、LVESP、LVEDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax差异具有统计学意义（P<0.01）。采用Pearson检验进行相关性分析，CPR后大鼠循环miR-21的表达量与HR、LVESP、+dp/dtmax、-dp/dtmax呈负相关（r= -0.563、-0.737、-0.755、-0.801，P<0.01），与LVEDP呈正相关（r=0.753，P<0.01）。见表2。

2.4 两组血浆中CK、CK-MB和cTnI的差异及miR-21与CK、CK-MB和cTnI的相关性

CK、CK-MB和cTnI在对照组和CPR组间差异具有统计学意义（P<0.01）。采用Pearson检验进行相关性分析，CPR后大鼠循环miR-21的表达量与CK、CK-MB和cTnI呈正相关性（r=0.658、0.733、0.852，P<0.01）。见表3。

表3 两组大鼠血浆中CK、CK-MB和cTnI比较（x±s）

2.5 miR-21、CK、CK-MB及cTnI在CPR大鼠的ROC曲线

CPR后大鼠miR-21表达水平的敏感性78.9%，特异性85.1%。采用ROC曲线（Receiver operating characteristic curve）评价循环miR-21相对表达量与心肺复苏后心肌损伤的诊断是否有价值。循环miR-21表达量ROC曲线下面积AUC=0.859（95%CI 0.731～0.988），与CK、CK-MB、cTnI具有相似的敏感度（AUC分别为0.719、0.803、1.000，95% CI分别为0.519～0.919、0.622～0.984、1.000～1.000）。见封三图3。

3 讨论

CA作为全身性的缺血缺氧性损伤过程，是临床中严重威胁人类健康的急危重症，死亡率极高[8]。50余年来，随着现代CPR术的建立、逐步完善与推广普及，越来越多的CA患者得到了及时的救治，但救治成功率仍差强人意，其中心功能障碍是患者成功复苏后早期死亡的直接原因之一[9]。本研究采用窒息法建立CA/CPR大鼠模型是經典的小动物复苏模型，具有制作方便、所需设备简单、重复性好的特点，能较好的模拟临床中缺氧所导致的CA与CPR过程。同时通过检测CK、CK-MB、cTnI能一定程度上反映病理条件下的心肌损伤，是经典的预警指标。本研究中发现，心肺复苏后大鼠HR、LVESP、±dp/dtmax较对照组均明显下降，LVEDP明显上升，提示CA/CPR后心功能障碍明显，尤其是左心收缩和舒张功能明显降低。同时提示心肌损伤的指标较对照组明显升高，提示CA/CPR后心肌细胞受损严重，而心肌细胞损伤则是CA/CPR后心功能障碍的根本原因。

miRNA是一类由22～23个核糖核苷酸组成的内源性非编码微小RNA，通常来源于长链RNA的初始转录产物（Pri-miRNA），其可在RNA诱导沉默复合物引导下与互补的信使RNA（mRNA）完全或不完全性配对，从而降解或抑制mRNA转录后翻译，调控着30%以上人类基因的表达[10-11]。研究发现，miRNA可存在于多种体液中，如尿液、唾液、血浆、血清等，其通过与LDL、HDL、Ago等结合形成具有酶活性的蛋白质复合物，以凋亡小体、微囊泡、外来体等形式稳定存在于体液中不被降解，即病理状态下组织表达的miRNA通过特定途径释放入血并可稳定存在[12-14]。因此，通过测定循环miRNA表达水平可一定程度上反映病理状态下特定组织的病理变化。

miR-21定位于液泡膜蛋白基因（vacuole membrane protein-1，VMP1）非编码区17q23.2，即VMP1的第十内含子，目前尚未发现特定的组织特异性。但研究发现，正常情况下miR-21在心肌中很少表达，但在各种病理条件下心肌miR-21表达明显升高，如急性冠脉综合征、心力衰竭、心肌肥厚、缺血性心脏病等[15-16]。研究已发现，miR-21具有心血管效应的靶基因有四个，分别是磷酸酯酶-张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10，PTEN）和程序性细胞死亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4）、Sprouty1、Sprouty2，上述基因均具有显著的细胞和条件特异性[17-19]，因此研究认为，心血管疾病过程中miR-21可能发挥了重要作用。杨寿娟等[5]研究发现，心肌梗死患者血浆miR-21较冠状动脉无病变者明显升高，提示其可能参与了心肌梗死后心肌损伤过程，并预言miR-21可能是急性心肌梗死潜在的诊断学标志物。

本研究中，血浆miR-21在CPR组中表达量较对照组明显升高，表明miR-21在CPR后心肌中表达活跃，此结果与一些学者[20-21]的研究结果一致，即心肌损伤时miR-21的表达明显上调，其可能参与了心肌缺血相关基因的调控，调控机制复杂，多种信号转导通路可能发挥作用，有待进一步研究。同时本研究还发现，心肺复苏后大鼠循环miR-21的表达量与心肌梗死诊断标志物CK、CK-MB、cTnI、LVEDP呈正相关性，与HR、LVESP、+dp/dtmax、-dp/dtmax呈负相关，即心肌损伤时miR-21表达上调，且与心功能障碍程度呈一定的相关性，提示miR-21可能参与了CPR后心功能障碍，有成为CA/CPR后心肌损伤诊断标志物的可能。ROC曲线下面积显示miR-21与CK、CK-MB、cTnI诊断CA/CPR后心功能障碍的效能相似，高于CK和CK-MB，稍低于cTnI，敏感性78.9%，特异性85.1%，据此推断miR-21可能是CPR后心肌损伤潜在的诊断学标志物，具有较高的敏感性和特异性，为未来的相关研究提供理论依据。endprint