阿司咪唑对斑马鱼心脏毒性的影响及其分子机制的研究

孙晨　韩利文　何秋霞

[摘要] 目的 以斑马鱼作为实验动物，研究阿司咪唑的心脏毒性及其分子机制。 方法 选择受精后24 h（24 hours post fertilization）的AB系斑马鱼作为实验动物，分别暴露于不同浓度的阿司咪唑培养液中，处理24 h后，统计其死亡率并在显微镜下观察心脏形态的改变，记录心率变化，利用RT-qPCR技术检测心脏功能相关基因表达的改变。结果 随着阿司咪唑浓度的升高，斑马鱼胚胎逐渐出现死亡、心囊水肿、心脏畸形、心率下降等情况；7种心脏功能相关基因（CAV1.3a、CAV1.3b、HCN2、HCN4、KCNH2a、KCNQ1和KCNE4）的表达均有所下调。 结论 阿司咪唑对斑马鱼胚胎的心脏毒性具有一定的剂量依赖性，且该心脏毒性的作用机制很可能是首先干扰心脏中各离子通道相关基因的表达，进而干扰离子通道的正常功能，最终引发心脏毒性。

[关键词] 阿司咪唑；斑马鱼；心脏毒性；分子机制

[中图分类号] R965 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）24-0041-05

[Abstract] Objective To study the cardiotoxicity of astemizole and its molecular mechanism by using zebrafish as the experimental animals. Methods Twenty-four post fertilization AB-zebrafish were selected as experimental animals and exposed to different concentrations of astemizole solution. After 24 h treatment， the mortality was calculated and the morphological changes of the heart were observed under the microscope. The heart rate changes were recorded. RT-qPCR technique was used to detect changes in cardiac function-related gene expression. Results As the concentration of astemizole was increased， zebrafish embryos gradually showed death， heart sac edema， heart deformity， heart rate decline and so on； the expression of seven cardiac function-related genes（CAV1.3a， CAV1.3b， HCN2， HCN4， KCNH2a， KCNQ1 and KCNE4） were down-regulated. Conclusion Astemizole has a dose-dependent effect on the cardiac toxicity of zebrafish embryos. The mechanism of cardiotoxicity is likely to first interfere with the expression of each ion channel-related genes in the heart， and then interfere with the normal function of the ion channel， ultimately leading to cardiotoxicity.

[Key words] Astemizole； Zebrafish； Cardiotoxicity； Molecular mechanism

近些年来，新药研发的投入虽有大幅提高，但成功上市的新药并没有相应的增多。主要原因即是在新药研发的不同阶段，特别是临床前试验阶段，许多化合物因安全性和有效性等因素而被迫中止研发；其中心脏毒性是最为常见的因素之一[1]。建立快速测定心脏毒性的筛选模型对药物进行早期预测评价，将有助于降低新药研发的后期成本、提高新药研发的成功率，因此对于降低新药研发的风险及上市药物的再评价等均具有非常重要的意义。

斑马鱼（zebrafish）作为一种新兴的脊椎动物模式生物，其个体较小、易于饲养、体外受精、体外发育、胚胎及幼鱼通体透明[2]，便于直接活体观测心血管系统的表型改变；且在基因水平上与人类之间的同源性高达87%，约70%的人类基因至少有一个明显的斑马鱼同源基因；在蛋白水平，斑马鱼的某些关键部分与人类的同源性更是几乎高达100%[3]。除此之外，斑马鱼的心脏构成与人类非常类似，均由心房和心室构成，房室之间存在瓣膜，且其心脏的发生和发育路线及基因调控机制等也均与人类相似[4-5]。基于上述多种特点，斑马鱼模型非常适用于心脏疾病和心脏毒理的研究。

阿司咪唑（Astemizole，AST）又称息思敏，属于第二代抗组胺类药物，是一种长效的H1受体拮抗剂[6]。由于该药在抗敏反应的同时无明显镇静作用，且起效快、吸收好、作用时间长，因此被广泛应用于过敏性疾病的治疗。然而由于阿司咪唑具有心脏毒性作用，因此又限制了其在临床上的用量。过量服用阿司咪唑可引起心脏Q-T间期延长、室性早搏、尖端扭轉性室性心动过速、房室传导阻滞、心跳骤停和心室纤颤等，严重者甚至引起死亡[7]。本研究选用AB系斑马鱼作为实验对象，研究了阿司咪唑对其心脏的毒性的影响及其作用机制，为斑马鱼心脏毒性模型的建立提供了可靠依据。endprint

1 材料与方法

1.1 实验动物

本实验采用的野生AB系斑马鱼，由山东省科学院药物筛选技术重点实验室提供。斑马鱼的饲养和繁殖参照文献[8]。雌雄斑马鱼在28℃，14 h光照/10 h黑暗条件下分开养殖，每日于9：30（am）和4：30（pm）分别喂食两次丰年虫。交配取卵时，于前日将健康成熟斑马鱼按雌雄比1：1或1：2的比例放入交配缸内，中间放置隔板，置于黑暗环境中，次日亮灯前抽去隔板，光照刺激使其排卵。排卵后半小时将成鱼捞出，使排卵时间控制在半小时内，以降低胚胎间发育时间的差异。收集受精卵，并对其进行消毒和清洗。随后将受精卵置于28℃培养箱内，保持14 h光照/10 h黑暗周期培养，并及时吸出死亡胚胎。

1.2 试剂与仪器

阿司咪唑标准品购自中国药检所，编号为100301。上述标准品使用二甲基亚砜（DMSO，国药）溶解后，分别配置成4、10和20 μmol/L 的工作液。三卡因（Tricaine）货号A5040和苯硫脲（PTU）货号P7629均购自美国Sigma公司。RNase-free水（RNase-free water）货号9012、RNA提取试剂盒（RNAiso Plus）货号9108、反转录试剂盒（PrimeScriptTM RT Master Mix）货号RR036A、 RT-qPCR试剂盒（SYBR Premix Dimer EeaserTM）货号RR091，均购自Takara公司。

奥林巴斯公司的1X51型倒置显微镜、奥林巴斯公司的SZX16型荧光体视显微镜、北京爱生科技有限公司的斑马鱼饲养繁殖系统、Thermo Forma公司的311型水套式二氧化碳培养箱、伯乐公司的iQ5实时荧光定量PCR仪。

1.3 加药处理

将24 hpf（hours post fertilization）的斑马鱼胚胎置于显微镜下，选取发育正常的胚胎，置于6孔板中，每孔100尾，每组3个平行孔。设置1个DMSO溶剂对照组（6 mL培养水中加入体积浓度0.5%的二甲基亚砜）和3种不同浓度的阿司咪唑实验组（6 mL培养水中加入终浓度为4 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L的阿司咪唑溶液）。将以上各实验组斑马鱼胚胎分别放入28℃恒温培养箱中，14 h光照/10 h黑暗周期下，分别培养24 hours。

1.4 阿司咪唑对斑马鱼心脏毒性影响的检测

各组斑马鱼加药处理24 h后，使用三卡因将其麻醉。在显微镜下观察统计斑马鱼死亡数量、心脏形态改变；并测量其心率，测量心率时采用显微镜下计数斑马鱼在1 min 内的心跳次数。

1.5 RNA提取

将各组斑马鱼置于RNAiso Plus中，使用研磨棒将其充分匀浆裂解。然后加入1000 μL氯仿，在转速12000 rpm条件下离心15 min。收集离心后的上清层，并添加等体积的异丙醇溶液，在转速12000 rpm条件下离心10 min。离心结束后弃去上清，添加1000 μL 75%的乙醇，在转速12000 rpm条件下离心5 min。离心结束后弃去上清，室温干燥沉淀，然后使用RNase-free水溶解RNA沉淀。

1.6 反转录

参照反转录试剂盒的说明，设定反转录的总体系为20 μL，其中包括4 μL的5×PrimeScript RT Master Mix和1000 ng的RNA。上述反应体系在37℃下放置15 min，然后置于85℃中5 s，反转录生成的cDNA置于-20℃冰箱中备用。

1.7 RT-qPCR

荧光实时定量PCR扩增反应的条件为95℃预变性 10 min，1個循环后，每个循环变性 95℃ 15 s，退火60℃ 1 min，共40个循环后，延伸65℃ 5 s，共61个循环，采集循环退火后的荧光信号。结果分析时以β-actin为内参，用MXPro软件对结果进行相对定量分析，同时对其进行统计学检测。各目的基因的引物序列见表1。

1.8 统计学方法

应用SPSS19.0软件进行统计学分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验，P>0.05为差异无统计学意义，P<0.05（或P<0.01）为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 阿司咪唑对斑马鱼的毒性影响

2.1.1 阿司咪唑对斑马鱼胚死亡活率的影响 24hpf的斑马鱼胚胎分别置于浓度0 μmol/L、4 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L的阿司咪唑溶液中，连续作用24 h后，计数其死亡率。结果显示：当阿司咪唑浓度为0 μmol/L时，斑马鱼胚胎未出现死亡现象；当阿司咪唑浓度为4 μmol/L或10 μmol/L，连续作用斑马鱼胚胎24 h时，亦未出现死亡现象；但是当阿司咪唑浓度为20 μmol/L时，斑马鱼胚胎开始出现死亡现象，且与对照组（阿司咪唑0 μmol/L处理组）相比，差异具有统计学意义（t=15.96，P<0.01），见表2。

2.1.2 阿司咪唑对斑马鱼心脏形态的影响 正常斑马鱼胚胎发育至24 hpf时，开始有色素生成。研究发现浓度为0.2 mmol/L的苯硫脲（PTU）可以抑制斑马鱼胚胎色素的形成，但并不影响其心脏的发育[9]。因此在本研究中，为了便于观察斑马鱼胚胎的心脏形态，在对照组及各实验组培养液中，均加入了浓度为0.2 mmol/L的苯硫脲。不同浓度的阿司咪唑作用斑马鱼胚胎24 h后检测发现：随着药物浓度的增加，斑马鱼胚胎均逐渐呈现心囊水肿、心脏畸形、血细胞堆积等现象，见封三图4。

2.1.3 阿司咪唑对斑马鱼心率的影响 24hpf的斑马鱼胚胎分别在不同浓度的阿司咪唑溶液中（0 μmol/L、4 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L）处理24 h后，在显微镜下计数斑马鱼胚胎1 min内的心跳次数，对其心率进行统计。结果如表3和图1所示：随着阿司咪唑浓度的增加，斑马鱼胚胎的心率均有所下降，且各实验组（阿司咪唑4 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L处理组）与对照组（阿司咪唑0 μmol/L处理组）相比，差异均具有统计学意义。endprint

2.2 阿司咪唑对斑马鱼心脏毒性影响的分子机制

将24hpf的斑马鱼胚胎分别置于浓度0 μmol/L、4 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L的阿司咪唑溶液中，连续作用24 h后，提取斑马鱼胚胎整体组织的RNA，并将其反转录为cDNA。以上述cDNA为模板，利用RT-qPCR技术，对多种与心脏功能相关的基因的表达情况进行检测。结果如图2所示：与对照组（阿司咪唑浓度0 μmol/L）相比，各实验组中的CAV1.3a、CAV1.3b、HCN2、HCN4、KCNH2a、KCNQ1和KCNE4七种基因的表达均有所下调。进行统计学分析后，上述基因表达的降低趋势均具有统计学意义。当不同浓度阿司咪唑处理斑马鱼胚胎24 h后，CAV1.3a和CAV1.3b两基因的下调趋势与阿司咪唑的作用浓度呈反比，即阿司咪唑的作用浓度越高，上述两基因的下调程度越小；而HCN2、HCN4、KCN2a、KCNQ1和KCNE4五种基因的下调趋势与上述两基因不同；当阿司咪唑的作用浓度为10 μmol/L时，HCN2、HCN4、KCN2a、KCNQ1和KCNE4等五种基因的下调程度最为显著。

3 讨论

传统的对药物的心脏毒性进行研究时，常以细胞或啮齿类动物作为研究对象，分别进行体外或体内实验。以细胞作为研究对象虽然具有快速高效等优势，但是其研究结果通常种属差异性较大。除此之外，有些药物的心脏毒性需要在體内经过代谢转化后才能显现，而细胞由于无法模拟上述过程，因此也就无法从机体水平对药物的心脏毒性进行综合全面的研究。以啮齿类动物如小鼠或大鼠等作为实验对象，进行体内实验，虽然具有综合全面、结果可靠等优势，但是该研究的周期通常较长，且用药量大。此外由于啮齿类动物的心血管系统需要解剖后才能观察其具体形态，因此无法实现药物心脏毒性的高通量快速筛选评价，以及心血管系统的可视化分析检测。斑马鱼由于体积较小，发育迅速，因此可在细胞培养板中进行大规模的同步实验，且用药量少，实验周期较短，实验过程便于操作，可实现药物心脏毒性的高通量快速筛选评价。斑马鱼在发育早期由于全身透明，因此在显微镜下可直接观察心血管系统的具体形态特征，可实现药物心脏毒性的可视化分析检测。本研究中，我们选择斑马鱼作为实验动物，在细胞培养板中对阿司咪唑的心脏毒性进行研究后发现：阿司咪唑对斑马鱼心脏具有一定的毒性作用，这与阿司咪唑心脏毒性的临床报道结果相符。我们发现阿司咪唑连续作用24hpf的斑马鱼胚胎24 h后，会导致其心脏出现心囊水肿、形态畸形和血细胞堆积等异常表型，同时还会造成其心率降低。这与过去小鼠实验的结果也相一致[10]。因此本研究进一步提示，以斑马鱼作为实验动物，对药物的心脏毒性进行体内研究，其结果真实可靠；斑马鱼是研究药物心脏毒性的新型理想动物模型。

许多研究已证实，阿司咪唑心脏毒性的作用机制与其影响心脏的起搏和阻滞心肌细胞K+通道的外向离子流密切相关[11-12]。因此在本研究中，我们对斑马鱼体内与心脏起搏和离子通道相关的7种基因：CAV1.3a、CAV1.3b、HCN2、HCN4、KCNH2a、KCNQ1和KCNE4等进行了研究。我们利用RT-qPCR技术首次研究发现，在斑马鱼模型中，阿司咪唑可干扰上述七种基因的正常表达。所以我们认为：阿司咪唑诱导斑马鱼发生心脏毒性的作用机制很可能是首先干扰心脏中各离子通道相关基因的表达，进而干扰离子通道的正常功能，最终引发心脏毒性。

虽然在斑马鱼中，阿司咪唑可抑制CAV1.3a、CAV 1.3b、HCN2、HCN4、KCNH2a、KCNQ1和KCNE4等基因的表达。但是其作用浓度与各基因的下调程度之间的剂量关系却不完全相同。CAV1.3a和CAV1.3b基因均参与编码Ca2+通道[13]，当浓度0 μmol/L、4 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L的阿司咪唑溶液分别作用斑马鱼时，上述两基因的下调程度与阿司咪唑作用浓度呈反比。该结果提示，阿司咪唑可通过干扰基因表达来影响Ca2+通道的功能，从而对斑马鱼心脏造成毒性。HCN2与HCN4是参与编码环核苷酸门控阳离子通道的基因[14]；KCNH2a、KCNQ1和KCNE4是参与编码K+离子通道的基因[15-17]。虽然HCN2、HCN4两基因与KCNH2a、KCNQ1和KCNE4三个基因编码的离子通道不同，但是在斑马鱼中，上述五种基因表达情况的改变与阿司咪唑作用浓度之间的剂量关系却很相似，即当浓度为0 μmol/L、4 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L的阿司咪唑溶液分别作用斑马鱼时，在10 μmol/L浓度下，上述五种基因的下调程度最大。该结果提示，阿司咪唑可通过干扰基因表达来影响环核苷酸门控阳离子通道和K+通道的功能，从而对斑马鱼心脏造成毒性。由于HCN2与HCN4两基因参与编码的离子通道与KCNH2a、 KCNQ1和KCNE4三种基因参与编码的离子通道中，均具有相同的GYG标准序列[18]，因此我们推测，HCN2、HCN4、KCNH2a、KCNQ1和KCNE4五种基因之间存在一定关联，该关联使它们对阿司咪唑的反应具有一定相似性。在下一步的研究中，我们将就上述五种基因之间的具体关联做进一步研究分析。

综上所述，本研究中我们以野生AB系斑马鱼作为实验动物，从表型及分子机制等两个层次分别对阿司咪唑的心脏毒性进行了体内检测，为斑马鱼心脏毒性模型的建立提供了可靠依据，并为今后研究药物的心脏毒性提供了新的实验依据。

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（收稿日期：2017-06-10）endprint