曼地亚红豆杉染色体核型分析

陈 亮，崔芬芬，宋 芸，朱琴梅，乔永刚

曼地亚红豆杉染色体核型分析

陈 亮1，崔芬芬1，宋 芸1，朱琴梅2，乔永刚1

(1.山西农业大学生命科学学院，山西 太谷 030801；2.介休市经贸局蔬菜基地建设办，山西 介休 032000)

利用曼地亚红豆杉硬枝扦插产生的不定根，进行根尖染色体制片，并做核型分析。结果发现，曼地亚红豆杉染色体数目为2n=2x=24，核型公式为2n=24=20m+2sm+2st，曼地亚红豆杉中部着丝粒染色体(m)为10对，近中部着丝粒染色体(sm)为1对，近端着丝粒染色体(st)为1对，曼地亚红豆杉核型为2A型。

曼地亚红豆杉；染色体；核型

曼地亚红豆杉(TaxusmediaRehd.)是以东北红豆杉(T.cuspidateSieb.et Zucc.)为母本，欧洲红豆杉(T.baccataL.)为父本，两者杂交形成的天然杂交种，原产于加拿大和美国。于1918年被美国学者发现，并在20世纪末引入中国，在世界范围内均有引种栽培。曼地亚红豆杉为常绿灌木，耐寒，能抵抗-25 ℃低温，生长速度快。部分红豆杉属植物含有抗肿瘤药物紫杉醇，但大部分该属植物仅树皮中有微量的紫杉醇。经大量研究发现，天然种红豆杉树皮中紫杉醇的含量一般在0.004%～0.010%之间，而曼地亚红豆杉紫杉醇含量则高达0.03%～0.06%，是天然种红豆杉的8倍～10倍。经美国FDA批准，曼地亚红豆杉可以用作提取紫杉醇。近年来，染色体核型分析成为诸多领域(如，染色体工程等)的重要研究手段，它与植物形态观察和基因组测序联合应用于植物的分类与遗传进化。笔者观察了曼地亚红豆杉染色体的数目和形态，并对其进行核型分析，旨在为曼地亚红豆杉的良种选育和栽培提供细胞学基础。此外，也为其在红豆杉属中的分类提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1材料

本试验所用材料为山西农业大学中药种质资源圃内扦插成活的2年生曼地亚红豆杉雌株。

1.2方法

1.2.1 根尖的获取

以曼地亚红豆杉扦插苗为材料，3月至6月早上8点至10点，切取不定根根尖，置于对二氯苯饱和水溶液中处理3 h～5 h.然后放入新配制的卡诺固定液(无水乙醇∶冰乙酸=3∶1)中固定24 h.固定后放入70%的酒精中保存，一般可保存1周至2周，如放入冰箱中(2 ℃～8 ℃)可保存数月。

1.2.2 细胞学制片

对王立等的细胞学制片方法进行改良，将固定好的材料用蒸馏水洗3次～5次，放入1 mol/L的HCl中，在常温条件下解离10 min左右。然后将材料转移至培养皿中，加入卡宝品红染色液(淹没材料即可)，染色20 min～30 min.用刀片切取已染色的根尖前部1 mm～2 mm，再进行纵切(一分为二)。然后将切下的根尖置于载玻片中央，滴加1滴染液后盖上盖玻片。将载玻片放在平整的桌面上，在盖玻片上放1层滤纸条，用左手手指压住，防止盖玻片滑动。再用铅笔带橡皮的一端垂直轻轻敲打盖玻片，使材料均匀散开，细胞分散压平。

1.2.3 镜检及核型分析

用Olmpus BX 51显微镜观察制好的曼地亚红豆杉根尖染色体片子，选择分散较理想、染色较清晰的中期染色体图像进行显微摄影。用Adobe Photoshop软件对拍摄的图片进行处理，并利用VIDEOTEST-KARYO 3.0自动核型分析软件进行分析，核型参数测量与核型分类方法按照李懋学等的方法。之后，按照乔永刚等的方法，在Office软件中利用染色体相对长度的参数制作出相应的染色体核型模式图。

2 结果与分析

2.1染色体数目

通过对50个染色清晰且分散良好的中期分裂相进行准确计数，最终确定曼地亚红豆杉染色体数为：2n=2x=24，具体形态，见图1.

图1 曼地亚红豆杉染色体和染色体核型图

2.2核型参数

笔者选取了5张比较清晰的曼地亚红豆杉染色体中期分裂相图片进行核型分析，确定其染色体数目为：2n=2x=24，核型公式为：2n=24=20m+2sm+2st.曼地亚红豆杉具体的核型参数，见表1.核型模式图，见图2.

表1 曼地亚红豆杉染色体参数

图2 曼地亚红豆杉核型模式图

由表1可以看出，曼地亚红豆杉中最长染色体与最短染色体的长度之比为3.43.整个染色体组中有8.33%的染色体臂比值大于2.0，在核型分类上属于2A型。曼地亚红豆杉的长臂总长/全组染色体总长(即核型不对称系数)为55.81%.在曼地亚红豆杉的12对染色体中，中部着丝粒染色体(m)有10对，占全部染色体总数的83.33%；近中部着丝粒染色体(sm)只有1对，占全部染色体总数的8.33%；而剩下的1对染色体为近端部着丝粒染色体(st)，也占全部染色体总数的8.33%.

3 讨论

染色体常规压片试验中有多个关键步骤会影响染色体制片质量。如，解离时间不够，则压片不易分散；解离时间过长，则会在下一步处理材料时，因材料过软而将根尖丢失。当解离时间过短，染色质也会有不同程度着色，从而影响显色摄影时的分色情况。当解离过度时，制作出的片子背景无色，染色体着色浅淡甚至不着色。只有掌握好解离的时间和程度，才可获得比较理想的染色效果，保证结果的可靠性。在使用盐酸解离材料后，需立即用蒸馏水将试验材料中残留的盐酸清洗干净，以免卡宝品红着色不均，或者不能着色。笔者将红豆杉根尖解离时间定为10 min，取得了很好的解离效果。

笔者研究得出曼地亚红豆杉的染色体数为2n=2x=24，曼地亚红豆杉的核型属于2A型。染色体数目与周其兴、王贵荣等的研究结果一致，红豆杉属的染色体数(2n=24)、染色体基数(x=12)一致。顾志建等研究了红豆杉属3种1变种以及白豆杉的核型，认为红豆杉属3种1变种的核型相似，建议合并为1种。其中，曼地亚红豆杉的母本东北红豆杉核型为2n=24=18m+4sm+2T.陈可咏最早报道了东北红豆杉的核型为2n=4M+10m+6msm+2sm+2T.以上研究中均发现了端部着丝粒染色体。笔者发现曼地亚红豆杉有2条近端着丝粒染色体，并未发现端着丝粒染色体。

参照Stebbins对植物界核型进化提出的分类学标准，即：由对称型向不对称型发展，核型越不对称则越进化。可以肯定曼地亚红豆杉是一种较为原始的物种。笔者首次报道了曼地亚红豆杉的核型分析数据，为今后曼地亚红豆杉的深入研究提供了细胞学依据。

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KaryotypeAnalysisofTaxusMedia

ChenLiang1，CuiFenfen1，SongYun1，ZhuQinmei2，QiaoYonggang1

(1.CollegeofLifeScience,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China；2.TheVegetableBaseConstructionOfficeofJiexiuCityEconomicandTradeBureau,Jiexiu032000,China)

The karyotype formulas ofTaxusmediawere studied based on the data of measurements of mitotic metaphase chromosomes.The results showed that the chromosome number was 2n=2x=24 and its karyotype formula was 2n=24=20m+2sm+2st.The metacentric chromosome (m) was 10 pairs,the submetacentric chromosome (sm) was 1 pairs and the subtelocentric chromosome (st) was 1 pairs.The karyotype ofTaxusmediabelonged to 2A Stebbins.

Taxusmedia；Chromosome；Karyotype

S791.49

A

1007-726X(2017)03-0037-03

2017-02-10

山西省科技攻关项目(20140312001-2)；山西农业大学育种基金(2014yz07)；山西省科技攻关项目(20130311023-4)；山西农业大学第十二批大学生科技创新项目(12-67)

陈 亮(1991— )，男，山西左权人，山西农业大学在读硕士研究生，生物化学与分子生物学专业。

乔永刚(1979— )，男，副教授，硕士研究生导师，在读博士，研究方向为药用植物遗传育种与栽培。