肛洗二号中药复方熏洗剂的含量测定及其临床应用

庞晓晨，成睿珍，李玥，赵飞，赵静

肛洗二号中药复方熏洗剂的含量测定及其临床应用

庞晓晨1，2，成睿珍1，2，李玥1，赵飞1，赵静1

目的：采用超高效液相色谱（UPLC）方法，建立中药复方熏洗剂中盐酸小檗碱、芦丁和槲皮素含量测定方法，并通过临床应用对照观察，阐明中药复方熏洗剂的临床药用价值。方法：采用ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色谱柱；以乙腈-0.1%甲酸为流动相进行梯度洗脱，流速0.3 mL/min，检测波长260 nm，柱温30℃。临床观察根据随机数字表法将患者分为治疗组和对照组，治疗组予以中药洗剂坐浴，对照组予1∶5000高锰酸钾溶液坐浴，疗程2周，观察两组手术后肛缘水肿例数及2周后疗效。结果：盐酸小檗碱、芦丁和槲皮素分别在(5.09～101.80)μg/mL、(10.13～202.60)μg/mL和(5.14～102.80)μg/mL范围内线性关系良好，平均回收率分别为100.73%、100.44%和100.73%（n=6）；RSD分别为0.59%、0.89%和0.76%。治疗组水肿160例，对照组为160例，治疗组2周后，治疗组总有效率95.65%，对照组为67.5%（P＜0.05）。结论：本实验含量测定方法简便、准确、重现性良好，为中药复方熏洗剂的质量控制提供了理论依据。临床应用研究表明，中药熏洗剂治疗痔疮有效、方便。

中药熏洗剂；混合痔；含量测定；超高效液相色谱法；临床应用

中药复方熏洗剂由黄柏、槐花、五倍子、乳香、没药等10多味中药组成，是多年临床治疗的经验方。根据湿热下注型混合痔术后表现为湿、热、瘀的临床症状，依靠其药力和热力作用于肛肠病变部位，使患处腠理疏通，气血流畅，有利于消除水肿、控制炎症，改善局部微循环、促进创口愈合的功效[1]。其中黄柏为君药，具有清热燥湿，泻火除蒸，解毒疗疮等功效，主要含小檗碱等多种活性成分，而小檗碱具有抗菌、抗炎、抗病毒等活性作用[2-3]。槐花具有凉血止血、清肝泻火的功效。现代研究表明，其主要成分为芦丁和槲皮素，均具有抗炎、止血、抗病毒等多种药理作用。本试验采用超高效液相色谱梯度洗脱法，同时测定黄柏有效成分盐酸小檗碱及槐花中有效成分芦丁和槲皮素；通过对熏洗剂的临床应用进行观察研究，阐明了中药熏洗剂的临床药用价值。

1 材料与方法

1.1 材料超高效液相色谱仪（Waters，Acquity，TUV Detector，Sample Manager-FTN，Quaternary Solvent Manager美国），AX205电子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司），台式通用冷冻离心机（THERMO FISHER美国），电热套（北京中兴伟业仪器有限公司）。

小檗碱对照品(批号110713-201212)，芦丁对照品(批号100080-201409)，槲皮素对照品(批号100081-201509)，中药饮片（购自天津市中药饮片厂有限公司和北京盛世龙药业有限公司，经天津滨海新区中医医院药剂科宋斌主管中药师鉴定，均符合2015年版《中国药典》一部规定），乙腈、甲酸均为色谱纯，水为超纯水。

1.2 色谱分析方法

1.2.1 色谱条件Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；以乙腈为流动相A，以0.1%甲酸水溶液为流动相B，按表1进行梯度洗脱；检测波长260 nm；流速0.3 mL/min；柱温30℃；进样量2 μL。

表1 梯度洗脱

1.2.2 对照品溶液的制备取盐酸小檗碱、芦丁和槲皮素对照品适量，精密称定，加甲醇制成含盐酸小檗碱101.80 μg/mL、芦丁202.60 μg/mL和槲皮素102.80 μg/mL的标准品储备液。

1.2.3 供试品溶液及阴性样品溶液的制备称取处方量饮片，放入砂锅中，加入适量水浸泡0.5 h，加水量为没过药材饮片半寸或一寸。先武火煎煮，煮沸后改为文火20 min，倒出第一次所煎药液。纱布过滤，收集续虑液。再次加水煎煮，方法同上。合并两次煎煮的续虑液。取1 mL续虑液至10 mL量瓶中，加甲醇定容，于离心机内离心10 min，取上清液，经0.20 μm滤膜，取续滤液，即得供试品溶液。按处方比例及制备工艺制备缺黄柏和槐花的阴性样品，称取相应量，如上处理，得阴性样品溶液。

1.2.4 专属性实验取盐酸小檗碱、芦丁和槲皮素的混合对照品、砂锅煎煮供试品和阴性样品溶液，进样。

1.2.5 标准曲线制备精密称取盐酸小檗碱、芦丁和槲皮素对照品适量，分别配成含盐酸小檗碱5.09、10.18、20.36、40.72、81.44、101.80 μg/mL、芦丁10.13、20.26、40.52、81.04、162.08、202.60 μg/mL和含槲皮素5.14、10.28、20.56、41.12、82.24、102.80 μg/mL的标准品溶液。按色谱条件进样2 μL，测定峰面积，以峰面积（Y）对浓度（X）进行线性回归。

1.2.6 精密度取混合对照品2 μL，按“2.1.1”项下方法测定峰面积，连续进样5次，测量盐酸小檗碱、芦丁和槲皮素的峰面积[4-5]。

1.2.7 重复性取同一供试品6份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，测定并计算盐酸小檗碱、芦丁和槲皮素含量[6]。

1.2.8 稳定性取同一供试品溶液，与室温下放置0、2、4、6、8、10、12、24 h分别进行含量测定。

1.2.9 加样回收率称取已测定含量的供试品溶液适量，精密称定，共6份，分别精密加入含一定量盐酸小檗碱、芦丁和槲皮素的对照品，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，依法测定样品中盐酸小檗碱、芦丁和槲皮素的含量，计算回收率[7]。

1.3 样品测定取3批处方量药材，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，分别测定盐酸小檗碱、芦丁和槲皮素的峰面积。

1.4 临床应用

1.4.1 临床资料本次研究共选取患者320例，根据随机数字表法将患者分为治疗组和对照组，各160例。治疗组男92例，女58例；年龄20～64岁，平均（45±5）岁。病程1～15年，平均（8±2）年。对照组男76例，女84例；年龄20～68岁，平均（43±5）岁。病程1～18年，平均（10±2）年。两组性别、年龄、病程等无统计学差异(P＞0.05)，具有可比性。

1.4.2 入选标准按照2006年中华医学会外科学分会结直肠肛门外科学组、中华中医药学会且肛肠分会和中围中西医结合学会肛肠分会联合制定的“痔临床诊治指南”中混合痔的诊断标准以及中华人民共和国中医药行业标准《中医病证诊断疗效标准》中痔的诊断依据。纳入标准：符合上述诊断标准且实施混合痔外剥内扎术。排除标准：合并其他肛肠疾病如瘘、胀肿等。

1.4.3 治疗方法两组均实施混合痔外剥内扎术。手术后治疗组使用中药熏洗剂坐浴。由制剂室统一煎制，真空包装，每剂两袋，每袋300 mL。加水至1500 mL，待药液温度合适（30℃～40℃），熏洗坐浴15～20 min，2次/d。对照组用1∶5000高锰酸钾溶液，熏洗坐浴，方法同上。共治疗2周[8]。

1.4.4 疗效评价标准参照《中医病症诊断疗效标准》制定。显效：混合痔术后伤口无水肿或水肿症状消失，水肿范围和疼痛基本消失。有效：混合痔术后伤口水肿症状好转，水肿范围缩小，疼痛减轻。无效：疗程结束时混合痔术后伤口水肿症状基本无改变，水肿范围和疼痛不变[9]。

1.5 统计学方法采用SPSS 19.0软件统计分析，计数资料比较用χ2检验，疗效比较用Riddit分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

1.6 样本量估算方法根据医学统计学两组样本率比较，选用以下方法进行样本量估算，计算公式为：

n为每组所需样本量，π1和π2分别为两组预期有效率（%），α为Ⅰ类错误的概率（根据本次研究需要，选0.05），β为Ⅱ类错误的概率（根据本次研究需要，选0.10），查f（αβ）表为10.5。通过前期临床研究发现，治疗组有效率约为95%，对照组有效率约为84%，代入上述公式。n=[96(100-96)+85(100-85)]× 10.5/(85-96)2=143.96≈144，即每组需要144例。按10%脱失率计算，每组不少于158例，故本实验选取160例。

2 结果

2.1 色谱分析方法结果

2.1.1 专属性进样结果阴性样品无干扰，证明此色谱条件可行。见图1。

2.1.2 标准曲线以峰面积（Y）对浓度（X）进行线性回归，盐酸小檗碱回归方程：Y=27362x-3505.9，r= 0.9999；芦丁回归方程：Y=13925x+3462.5，r=0.9999；槲皮素回归方程：Y=26765x-6933.5，r=0.9999。结果表明盐酸小檗碱、芦丁和槲皮素线性关系良好。

2.1.3 精密度测得盐酸小檗碱、芦丁和槲皮素峰面积值的RSD分别为1.40%、0.73%和0.81%，精密度符合要求。

2.1.4 重复性测定并计算盐酸小檗碱、芦丁和槲皮素含量的RSD分别为1.06%、0.53%和0.94%，重复性良好。

图1 UPLC色谱图

2.1.5 稳定性以峰面积为指标计算盐酸小檗碱、芦丁和槲皮素的RSD分别为1.30%、1.13%和1.29%，说明供试品溶液在24 h内稳定。2.1.6加样回收率加样回收率结果见表2。表明盐酸小檗碱、芦丁和槲皮素的平均回收率分别为100.73%、100.44%和100.73%，RSD均小于1%。

表2 加样回收率实验结果

2.2 样品测定样品测定结果见表3。表明盐酸小檗碱的含量分别为0.439、0.441、0.432 mg/g；芦丁的含量分别为4.070、4.124、4.065 mg/g；槲皮素的含量分别0.400、0.399、0.394 mg/g，RSD均小于2%。

表3 含量测定结果(mg/g)

2.3 临床应用结果由结果可知，两组比较，治疗组手术后肛缘水肿例数明显低于对照组（P＜0.05）。详见表4。2周后疗效比较，治疗组总有效率明显高于对照组（P＜0.05）。详见表5。

表4 两组患者手术后肛缘水肿例数比较(n,%)

表5 两组患者2周后疗效比较

3 讨论

试验以甲醇为溶剂，对熏洗剂进行了全波长扫描，盐酸小檗碱的最大吸收波长为265 nm，芦丁和槲皮素的最大吸收波长为257 nm。经过考察不同波长时几种成分的含量变化，最终实验选择260 nm作为检测波长，此时3种成分的含量均较高，且与杂质峰分离度较好，基线平直[10]。

此外，我们首先以甲醇-水系统、乙腈-水系统为流动相，采用等度洗脱，结果表明，各组成分无法完全分离，保留时间也相对较长。考虑到复方制剂成分复杂，采用梯度洗脱能更好地调整各组分的出峰时间，优化各组分的分离度[11]。

本实验采用梯度洗脱，分别考察了甲醇-水系统、乙腈-水系统、甲醇-0.1%甲酸水溶液系统、乙腈-0.1%甲酸水溶液系统等不同流动相体系对实验的影响。结果显示，当采用甲醇-水系统、乙腈-水系统作为流动相，盐酸小檗碱出峰时间较晚，且各色谱峰有不同程度的拖尾现象，其中盐酸小檗碱拖尾特别严重，加入少量甲酸后可有效改善拖尾现象，使峰型较好。采用乙腈-0.1%甲酸水溶液系统比甲醇-0.1%甲酸水溶液系统更为理想，分离度较好，峰对称性较好，并能达到基线分离。综合考虑，最终选用乙腈-0.1%甲酸水溶液为本实验的流动相。

在实验过程中，选取了不同浓度的甲醇对样品进行稀释，分别为去离子水、50%甲醇和100%甲醇，结果发现，使用去离子水稀释样品后，样品中的盐酸小檗碱几乎没有峰值，50%甲醇稀释样品后，盐酸小檗碱峰值较小，槲皮素色谱峰分离度也较差，而使用100%甲醇稀释样品后，芦丁、盐酸小檗碱和槲皮素3种成分的色谱峰均有较好的分离度，峰对称性也很好，因此，本实验选取100%甲醇对样品进行稀释。

本复方由12味中药构成，成分较为复杂，使用普通高效液相色谱仪检测可能分离成分的效果较差，保留时间也比较长。本实验采用的超高效液相色谱法（UPLC）是在传统普通高效液相色谱的基础上建立的一种新的色谱分析方法，使用了粒径低于2 μm的颗粒作为填料以达到增加柱效的目的，良好的分离速度和分离度更适合于中药复方多指标成分的定量检测[12-13]。

因此，本文采用高效性液相色谱法对中药复方熏洗剂进行含量测定，选取多种药效活性成分作为评价指标，建立了高效、快速、准确的UPLC测定方法。该方法可以大大降低复杂中药复方制剂的分析时间，并且经方法学验证，测定结果准确，具有良好的重复性，为中药复方熏洗剂的质量控制以及该方进一步的开发利用提供有力保障。

肛肠病术后出现的疼痛、肿胀、出血等症状，发病以风、湿、热、瘀为主，其病因病机多为湿热阻滞、气血凝聚、经络阻隔或湿热下注、热伤肠络或湿热阻滞肛门皮肤[14-15]。熏洗疗法是中医外治法常用的治疗方法，由于熏洗能使药物直达病所，奏效迅捷[16]。方中苦参、黄柏祛风、除湿、止痒；槐花、五倍子凉血止血，涩肠固脱，用于痔疮出血，脱岗不收；没药、乳香宣通脏腑，流通经络。诸药合用，共奏清热利湿、泻火解毒、消肿止痛之功。故用于肛肠病，可改善症状，加速伤口愈合。经多年临床应用，疗效显著。

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Content Determination and Clinical Application of Gangxi Ⅱ Chinese Medicine Fumigation Agent

PANG Xiao-chen，CHENG Rui-zhen，LI Yue，et al.Department of Pharmacology,Chinese Medicine Hospital of Tianjin Binhai New Area,Tianjin(300451),China

ObjectiveTo establish the method for determination of berberine,rutin and quercetin hydro⁃chloride concentration in a Chinese herbal compound fumigating lotion using ultra performance liquid chromatog⁃ raphy(UPLC)and to elucidate the clinical value of this fumigating lotion by clinical application and con⁃trolled observation.MethodsThe ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)column wasused and the gradient elution of acetonitrile-0.1%formic acid as mobile phase was carried out with a flow rate of 0.3 mL/min，a detection wavelength of 260 nm and a column temperature of 30℃.The clinical observation was divided into the treatment group and the control group according to the random number table method.The treatment group

lotion hip bath and the control group were given 1:5000 potassium permanganate hip bath.After 2 weeks of treatment,the number of anal margin edema after surgery and the therapeutic effect for 2 weeks were observed.ResultsThe calibration curves for berberine hydrochloride,rutin and quercetin were linear in the ranges of(5.09～101.80)μg/mL,(10.13～202.60)μg/mL and(5.14～102.80)μg/mL,respectively and their linearity was good.The average recoveries were 100.73%，100.44%and 100.73%(n=6),respectively.RSD were 0.59%,0.89%and 0.76%,respectively.There were 160 cases of edema in the treatment group and 160 cas⁃es in the control group.The total effective rate was 95.65%in the treatment group and 67.5%in the control group(P＜0.05).ConclusionThe method is simple,accurate and reproducible which provides a theoretical basis for the quality control of traditional Chinese medicine compound fumigants.Clinical application studies suggested that the treatment of hemorrhoids using Chinese herbal medicine fumigation agent was effective and convenient.

Chinese herbal medicine fumigation;mixed hemorrhoids;content determination;ultra perfor⁃mance liquid chromatography;clinical application

R285.6

A

1007-6948(2017)05-0527-05

10.3969/j.issn.1007-6948.2017.05.017

天津市中医药管理局天津市卫生和计划生育委员会中医中西医结合科研课题（2015144）1.天津市滨海新区中医医院药学科（天津300451）2.天津中医药大学（天津300193）

赵静，E-mail:dr_zhaojing@163.com

（收稿：2017-01-26 修回：2017-09-05）

（责任编辑 刘洪斌）