洋河大曲产核苷功能菌的研究

李国友，陈 翔，米 娇，杨 勇，杨 涛，周新虎，唐佳林，庄名扬，吴林蔚

（1.中国科学院成都生物研究所，四川成都610041； 2.江苏洋河酒厂股份有限公司 江苏宿迁223800）

洋河大曲产核苷功能菌的研究

李国友1，陈 翔2，米 娇1，杨 勇2，杨 涛1，周新虎2，唐佳林1，庄名扬1，吴林蔚1

（1.中国科学院成都生物研究所，四川成都610041； 2.江苏洋河酒厂股份有限公司 江苏宿迁223800）

利用涂布法、划线法等技术手段，从洋河成品大曲中分离得到1株代谢产生核苷类健康功能因子的丝状真菌。利用形态观察和分子生物学相结合的技术手段，将核苷代谢功能菌鉴定为横梗霉。高效液相分析表明，该菌可代谢产生具有重要生理活性的次级代谢产物——腺苷和尿苷。该研究为核苷健康功能菌在中国白酒酿造中的应用奠定了基础。

微生物； 大曲； 丝状真菌； 横梗霉； ITS； 核苷

大曲是酿造名优白酒及独特风味白酒的基础之一[1]，在白酒酿造过程中起着重要作用。大曲中的微生物种类多种多样，且相互作用，功能微生物能够代谢产生各种结构类型丰富，生物活性显著的次级代谢产物。因此，大曲不仅是白酒酿造功能微生物群的载体，也是香味及前驱物质的来源，更是白酒健康功能因子的源泉，其对白酒的品质具有十分重要的影响[2-3]。前期，我们首次从江苏洋河酒厂的大曲中分离得到了能产腺苷、尿苷等核苷类活性化合物的丝状真菌，该类次级代谢产物具有免疫调节、改善脑细胞代谢、镇静中枢神经等广泛的药理生理活性[4]。腺苷是一种遍布人体细胞且具有重要生理功能的内源性物质[5]，是人体循环系统疾病的药物[6]；在临床上可直接作为心血管和循环系统疾病的药物，能促进冠状血管扩张[7]和血管生成、增加毛细血管的密度[8-9]，能缓解炎症，具有抗炎作用[10]，同时也是多种抗病毒药物合成的中间体；尿苷具有治疗肝病和心脑血管疾病的功能。目前核苷类化合物已作为药品、保健品和食品添加剂得到了广泛的应用。

随着人们健康意识的增强，饮用健康白酒的理念越来越深入人心，开发具有良好生理活性的健康型白酒是中国白酒的必然发展趋势，因此从大曲中发现能够代谢产生健康功能因子的功能菌，并将其应用到健康白酒的酿造中，对于促进中国白酒的健康发展具有十分重要的意义。本实验采用涂布法、划线法等传统微生物分离纯化的方法，对洋河大曲中能够代谢产生核苷健康功能因子的菌进行了分离、筛选和鉴定，获得了1株能够产核苷类活性化合物的丝状真菌，利用形态和分子生物学相结合的方法对其进行了鉴定。在此，本文对该菌的分离纯化和分子鉴定工作进行报道，该研究为洋河大曲核苷功能菌开发应用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 材料

大曲样取自江苏洋河酒厂股份有限公司。

1.1.2 仪器

高效液相色谱（上海伍丰色谱仪），SW-CJ-1FD洁净工作台（苏净集团苏州泰安空气技术有限公司），DH-600型电热恒温培养箱（北京中兴伟业仪器有限公司），DZKW-4电子恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司），SHZ-D循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司），PCWJ-20超纯水机（成都品成科技有限公司），DL-1万用电炉（北京中兴伟业仪器有限公司），BH-2型光学显微镜（OLYMPUS），TG16-W微量高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发公司），PCR仪（Eppendorf Thermal Cycler），电泳仪（Bio-Rad）。

1.1.3 试剂

真菌平板分离培养基：马丁-孟加拉红培养基，葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，孟加拉红33.4 mg，卡那霉素20 mg，琼脂15 g，纯水1000 mL，121℃灭菌20 min。

发酵培养基：麸皮10 g，葡萄糖0.2 g，纯水7.5 mL，121℃灭菌30 min。

标品：腺嘌呤核苷，鸟嘌呤核甘，胸腺嘧啶核甘。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种分离

在超净工作台中粉碎曲块，取10 g大曲中心部位样品加入装有90 mL无菌水的三角瓶中，在培养箱中以150 r/min、室温振荡30 min。再进行逐级稀释，取合适稀释倍数的菌悬液在真菌分离培养基上进行平板涂布。然后将平板置于温度为30℃的培养箱中培养。经过适当的培养时间，选择菌落形态有明显差异的菌株分离、纯化和保藏。

1.2.2 菌种筛选

真菌以30℃静置培养15 d。发酵完成后，加入100 mL 70%vol乙醇，在60℃条件下水浴4 h，再将提取液过滤，提取2次，合并滤液，减压浓缩获得浸膏。所得浸膏各取20 mg，加入1 mL超纯水，滤膜过滤，HPLC分析（分析条件：检测波长258 nm；柱温30 ℃；流量0.8 mL/min；甲醇/水梯度洗脱：0～30 min，0%～25%）。

1.2.3 菌种鉴定

1.2.3.1 菌种形态、生化鉴定

真菌菌落形态鉴定：以无菌操作，分别将经融化并冷却到45℃左右的PDA培养基倾注于培养皿中，培养基凝固后即成平板。从菌株斜面上挑取少量孢子点到上述平板适当位置，30℃倒置培养，观察菌落形态。

真菌显微形态观察：采用湿室载片培养法，在培养皿底部铺一张略小于皿底的圆滤纸片，再放1个U形玻棒，其上入一块洁净载玻片和2块盖玻片，盖上皿盖，包扎后以121℃灭菌30 min，烘干备用。取已灭菌的PDA培养基6～7 mL注入另一灭菌平皿中，使之凝固成薄层。用解剖针切取0.5～1 cm的琼脂块，并将其移至上述培养室中的载玻片上。用尖细的接种针挑取少量孢子接种于琼脂块的边缘上，用无菌镊子将盖玻片覆盖在琼脂块上。在平皿的滤纸上加3～5 mL灭菌的20%甘油，盖上皿盖，30℃培养。一定培养时间后取出载玻片，在光学显微镜下观察显微形态。

1.2.3.2 菌种分子鉴定

真菌采用ITS[11]序列分析的方法对菌种进行鉴定，真菌通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和IST4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')用于真菌ITS序列的扩增。PCR扩增体系为：模板DNA 2 μL，引物1和引物2各 1 μL，10×PCR 缓冲液 2.5 μL，Hifi酶 0.5 μL，dNTP 2 μL，无菌超纯水16 μL。PCR反应程序为：94℃预变性4 min后进行32个循环，每个循环包括94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸45 s，最后一个循环72℃延伸10 min，4℃保存。

2 结果与讨论

2.1 菌株筛选

累积分离得到71株菌，其中细菌31株，真菌40株。通过高效液相（HPLC）技术对分离菌株发酵产物进行分析，最终筛选得到1株产核苷类化合物的菌株（图1和图2），鉴定为横梗霉（Lichtheimia ramosaYH2.3.4）。

图1 标准品HPLC检测谱图

图2 Lichtheimia ramosa YH2.3.4发酵液HPLC检测谱图

2.2 菌种鉴定结果

2.2.1 菌种形态鉴定结果

Lichtheimia ramosaYH2.3.4型态观察结果：菌落生长迅速，初为白色，后为灰白色，反面无色，有假根，孢囊梗由生假根处的匍匐菌丝生出，分枝或不分枝，顶端膨大成中轴基，孢子囊半球形或球形，孢囊孢子多呈球形（图3）。

图3 横梗霉显微照片

2.2.2 菌种分子鉴定结果

将扩增过的DNA片段进行测序，测序结果在NCBI的Genbank数据库中进行BLASTN同源性比对，根据相似度鉴定出菌株的种属，再结合形态学结果，将该菌鉴定为横梗霉（Lichtheimia ramosa）。横梗霉ITS测序结果：

5’-CCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACTGAGAGGTCTAAAAAACCACTAGTTGGGGGT CTCTTCCCCTCTAGTAGTTCCTCACAGTTTTGT GCAAAGTCGGGTCAACTTGGTTGGCTCTGCCT TGTGCTGTAGATCTGGTTGTTGGCATAGAGACC CTCCTTTTAGGAGACTTGTGCCACTACTAAGAT CTAGGCTGCTTGAAAAGAGACGTATGGACCCT TCTTTCAGGAGACCTATGTCTCGAGTCAAAGC AAGCAAGGCAAGCCTTTGGGGCTCTAGTACTA ACTATCCCCAAAGGTGTTTATTCTTCTCGTGTA AACCATGATGTACGAAAAAGTTAGTTGTTAAC TTAAAAACAACTCTTGGCAATGGATCTCTTGGT TCTCGCATCGATGAAGAGCGTAGCAAAGTGCG ATAATTATTGCGACTTGCATTCATAGCGAATCAT CGAGTTCTCGAACGCATCTTGCGCCTAGTAGT CAATCTACTAGGCACAGTTGTTTCAGTATCTGC AACTACCAATCAGTTCAACTTGGTTCTTTGAAC CTAAGCGAGCTGGAAATGGGCTTGTGTTGATG GCATTCAGTTGCTGTCATGGCCTTAAATACATT TAGTCCTAGGCAATTGGCTTTAGTCATTTGCCG GATGTAGACTCTAGAGTGCCTGAGGAGCAACG ACTTGGTTAGTGAGTTCATAATTCCAAGTCAAT CAGTCTCTTCTTGAACTAGGTCTTAATCTTTAC GGACTAGCGAGAGGATCTAACTTGGGTCTTCT CTTAAACAAACTCATATCTAGATCTGAAATCAA CTGAGATCACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA-3’

3 讨论

本实验首次从洋河成品大曲中分离得到1株可以代谢产生腺苷、尿苷活性成分的功能性微生物，并利用分子生物学的技术将其鉴定为横梗霉。本研究为洋河大曲中核苷活性功能因子的来源提供了依据，也为洋河大曲核苷功能菌在白酒酿造中的应用奠定了基础。

[1]李凯,彭敦磊,孙端方.传统大曲微生物多样性技术研究[J].酿酒科技,2015(9)：33-36.

[2]王旭亮,王德良,王异静,等.大曲微生物及其内在物质对酵母酒精发酵的协同作用[J].酿酒科技,2014(10)：1-5.

[3]印璇,冯英志,韩兴林,等.北方酱香大曲培曲过程中微生物变化的分析研究[J].酿酒科技,2015(1)：1-6.

[4]王锐.嘧啶核苷的研究进展[J].生物技术通讯,2007(3)：539-542.

[5]朱文玲.腺苷在心血管病诊治中的应用前景[J].中华心血管病杂志,2004(10)：87-90.

[6]柏建新,张一平,朱晓宏,等.微生物发酵生产腺苷的研究[J].食品与发酵工业,2001(3)：16-20.

[7]WILSON R F,WYCHE K,CHRISTENSEN B V,et al.Effects of adenosine on human coronary arterial circulation[J].Circulation,1990,82(5)：2208-2209.

[8]陈文.腺苷及其受体在心血管组织工程中的作用及机制研究[D].重庆：第三军医大学,2015.

[9]BERNE R M.The role of adenosine in the regulation of coronary blood flow[J].Circulation research,1980,47(6)：807-813.

[10]蒋激扬,刘发.腺苷的抗炎作用[J].中国药理学通报,1998(S1)：79-82.

[11]罗惠波,王彩虹,甄攀,等.基于ITS基因文库法研究清香型大曲真菌群落结构[J].酿酒科技,2014(5)：31-35.

贵州“黔酒”国家级专家品鉴会在筑举行

本刊讯：2017年9月7日，由贵州省酿酒工业协会、贵州黔酒股份有限公司主办的“黔酒股份国家级专家品评会”在贵阳举行。中国白酒著名专家高月明、高景炎，以及著名白酒专家、首届中国酿酒大师、茅台原总工程师吕云怀，著名白酒专家、水井坊总工赖登燡，《酿酒科技》杂志总编黄平、贵州大学明德学院院长吴天祥，著名白酒专家高军，四川郎酒股份有限公司总工沈毅，贵州董酒股份有限公司总工李其书、贵州省知名白酒专家方长仲、贵州省质检院部长孟望霓等共11位专家莅临会场，会议由黄平总编主持。

贵州黔酒股份有限公司董事长张方利致辞，对各位莅临指导的专家及与会来宾表示感谢，并就公司的建立及发展历程作了简介。张方利董事长对此次品鉴会的4个酒样——“黔酒一号珍品十五”“黔酒一号国标酱香”“黔酒一号天酿藏香”“黔酒一号馆藏封坛”进行了介绍。经过认真细致的品鉴，各位专家均形成自己的品评意见。其中，高月明老先生发表感言，评价4款酒大体风格一样，个性有差异，都是比较好的酱香白酒，产品的性价比也合理。专家组经过规范、认真的现场品评，对4款酒给出了评语并发言，最后形成鉴评综合意见，如下：

黔酒一号珍品十五：微黄透明，酱香突出，陈香舒适，醇厚协调、回味悠长、空杯留香持久、大曲酱香酒风格典型。黔酒一号国标酱香：微黄透明，酱香优雅，酒体醇厚、回味绵长、空杯留香久、大曲酱香酒风格典型。黔酒一号天酿藏香：微黄透明，酱香明显，香味协调、醇和柔顺、回味长、空杯留香久、大曲酱香酒风格典型。黔酒一号馆藏封坛：微黄透明，酱香明显，醇和协调、回味绵长，空杯留香久、大曲酱香酒风格典型。品评会结束时，白酒专家委员会主任委员高景炎老先生做了总结发言，各位专家均在品鉴意见上签字，并与公司主要领导合影留念。（小雨、萤子、晓文）

Study on Nucleoside-Producing Fungus Isolated from Yanghe Daqu

LI Guoyou1,CHEN Xiang2,MI Jiao1,YANG Yong2,YANG Tao1,ZHOU Xinhu2,TANG Jialin1,ZHUANG Mingyang1and WU Linwei1
(1.Chengdu Institute of Biology,Chinese Academy of Sciences,Chengdu,Sichuan 610041;2.Yanghe Distillery Co.Ltd.,Suqian,Jiangsu 223800,China)

A nucleoside-producing fungus strain was isolated from Yanghe Daqu by using spread plate and streaking.On the basis of morphological and molecular analysis,it was identified asLichtheimia ramosa.HPLC analysis showed thatLichtheimia ramosacould produce adenosine and uridine with diverse bioactivities.This study laid the foundation for the application of nucleoside-producing fungus in Baijiu production.

microbe;Daqu;mycelial fungus;Lichtheimia ramosa;ITS;nucleoside

TS262.3；TQ925.7；TS261.1；Q93-3

A

1001-9286（2017）10-0024-04

10.13746/j.njkj.2017197

2017-07-14

李国友（1977-），男，羌族，理学博士，主要从事活性天然产物研究工作，E-mail：ligy@cib.ac.cn。

优先数字出版时间：2017-08-17；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170817.1428.010.html。