慢病毒介导的靶向沉默HPV16 E7⁃shRNA对SiHa细胞DNA甲基转移酶表达的影响

杨佳 李黎明 许翠 龙嘉 王尧 杨雪源 蒋明军

210042南京，中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病研究所中心实验室 江苏省皮肤病与性病分子生物学重点实验室（杨佳、李黎明、许翠、龙嘉、杨雪源、蒋明军）；南京农业大学生命科学与技术基地班（王尧）

·论著·

慢病毒介导的靶向沉默HPV16 E7⁃shRNA对SiHa细胞DNA甲基转移酶表达的影响

杨佳 李黎明 许翠 龙嘉 王尧 杨雪源 蒋明军

210042南京，中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病研究所中心实验室 江苏省皮肤病与性病分子生物学重点实验室（杨佳、李黎明、许翠、龙嘉、杨雪源、蒋明军）；南京农业大学生命科学与技术基地班（王尧）

目的 探讨慢病毒携带的靶向人乳头瘤病毒16（HPV16）E7基因的短发夹干扰RNA（shRNA）对HPV16阳性宫颈癌SiHa细胞中4种甲基转移酶（DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L）表达水平的影响。方法 构建HPV16 E7基因靶序列的shRNA重组质粒，用BLOCK⁃iT™Lentiviral RNAi Expression System试剂盒进行慢病毒包装，分别转染293T细胞48、72 h后收集病毒上清液。分别用含靶向HPV16 E7⁃shRNA重组质粒的病毒上清液与完全培养基（1∶1）的混合液（shRNA组）、含空白质粒（即不含靶向HPV16 E7⁃shRNA序列）的病毒上清液与完全培养基（1∶1）的混合液（阴性对照组）、完全培养基（空白对照组）培养SiHa细胞。感染0、48、96 h后，用实时荧光定量PCR（qRT⁃PCR）检测3组SiHa细胞中HPV16 E7和4种甲基转移酶mRNA的表达，Western印迹检测4种甲基转移酶的蛋白表达。结果 感染0 h时，shRNA组、阴性对照组、空白对照组SiHa细胞HPV16 E7、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L mRNA相对表达量比较，差异无统计学意义（均P＞0.05）；感染48、96 h时，3组细胞间HPV16 E7和4种DNMT mRNA相对表达量比较，差异有统计学意义（均P＜0.05）。shRNA组HPV16 E7、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L mRNA表达水平在48 h时的沉默效率分别为71.13%、50.53%、13.72%、46.27%和17.92%，96 h时分别为83.50%、74.2%、47.8%、64.7%和48.9%；……