基于富集微流控芯片的稻曲病菌孢子光电检测方法

杨 宁，王 盼，张荣标，徐佩锋，孙 俊，毛罕平



基于富集微流控芯片的稻曲病菌孢子光电检测方法

杨 宁1,2，王 盼1，张荣标1※，徐佩锋1，孙 俊1，毛罕平2

（1. 江苏大学电气信息工程学院，镇江 212013； 2. 江苏大学农业工程研究院，镇江 212013）

针对当前水稻真菌病害发病时间短、传播速度快，缺乏有效早期预警技术的难点，提出一种基于微流控芯片的空气流中水稻真菌病害光电检测方法。该文根据微尺度下孢子富集动力学特征设计了病害孢子高效富集微流控芯片，并结合光电检测系统进行病害孢子的检测。试验根据空气动力学原理以及孢子富集量的大小对微流控芯片通道尺寸进行设置。根据光检测原理和不同浓度孢子在富集区形成的光衰减特性，筛选具有高灵敏度特性的检测光强。在以检测光谱的灵敏度性能为目标并综合考虑线性度的基础上，优选检测波长。以水稻稻曲病菌孢子为检测对象，进行了自动化微流控富集和光电检测试验。试验结果表明：在光源光强1.1×104cd，波长为650 nm时，利用所述检测方法针对水稻稻曲病菌孢子检测结果（相比与镜检值）误差小于17.5%，根据检测结果建立相关系数为0.992 9的检测模型，具有较好的线性度及可靠性。研究结果为便携式作物病害检测装备的研发提供理论基础。

病害；灵敏度分析；模型；微流控芯片；真菌；光电检测

0 引 言

稻曲病等作物真菌病害因其传播速度快、危害大等问题已成为农业工程领域面临的世界性难题[1-2]。而目前，传统的解决方式仍主要为粗放、盲目的喷洒农药，由此造成的农药残留污染对人体健康造成了极大的危害[3-6]。因此，运用智能化手段对病害传播途径中的真菌孢子进行高效检测，实现作物病害早期预警已成为农业工程领域的研究热点[7]。

现阶段真菌孢子的检测手段主要有称重法[8]、图像法[9]。称重法是通过大量沉积真菌孢子，并利用称重传感器实现定量计算的检测方法，然而该方法缺少快速有效的富集手段，使得检测时间过长，往往错过最佳施药期，并且野外的复杂环境会对称重精度产生较大影响。传统的图像法由肉眼观察显微图像并计算孢子数量来完成，该方法检测时间长、人力资源消耗大、自动化程度低。而目前利用图像法进行自动识别真菌孢子个数技术也逐步出现，例如李小龙等[10]、齐龙等[11]利用图像处理方法对捕捉好的孢子均实现孢子个数的准确计数；姜玉莹等[12]将自动对焦显微镜集成到孢子捕捉仪上实现捕捉数量的大概计数，但是这种方法依旧需要借助显微镜或高精度电子天平等昂贵的仪器进行辅助检测，因而无法在市面上推广实施。此外，免疫法[13]、核酸检测法[14]、微悬臂梁检测法[15]等也是常见的微生物快速检测法。免疫检测利用抗原和抗体的特异性结合能够较高精度实现特定微生物浓度的快速检测。核酸检测法利用分子扩增技术也能够大大减少检测时间，并进一步提高检测灵敏度。但上述方法往往需要特异性抗体或引物以及专业的人员及设备，难以实现野外实时检测[16]。此外，关于病害真菌孢子的抗体提取研究尚不成熟。微悬臂梁检测法则是一种通过在微悬臂梁表面修饰敏感材料或者受体分子达到对待检目标气体或液体分子进行吸附，从而利用微悬臂梁运动状态变量标定待检物浓度的方法。如Nugaeva等[17]使用镀金和未涂覆的硅微机械悬臂阵列快速定量检测黑曲霉和酿酒酵母。该方法具有高精度与高灵敏度特点。但是微悬臂梁检测法对检测环境要求严格，难以适应复杂的大田环境条件[18]。

随着微纳米技术加工工艺水平的发展，近年来微流控芯片技术因其尺度微小、具备微分离及富集等功能、光学性能好等[19-21]优点已进入农药残留检测[22-23]、水产致病菌检测[24]等农业工程相关领域。例如郭建江等[25]在微流控芯片中利用磁控富集等手段，实现超低浓度的水产致病菌的快速检测。Wang等[19]通过在微流控芯片内设计鱼骨型富集区，从而实现对细胞的高效捕捉，并采用光学手段实现了对肿瘤细胞的检测。目前，在液体环境中对细胞进行富集和检测手段较多[26-29]，然而课题所涉及的利用微流控芯片对空气中的孢子进行富集，并利用光学原理进行检测的研究还未见报道。

因此，论文将富集原理与光检测原理相结合，通过设计具有孢子富集功能的微流控芯片和光电检测系统，提出一种基于微流控芯片的水稻稻曲病真菌病害光电检测方法，实现超微浓度气传孢子的高效检测。

1 系统设计

1.1 微流控芯片的设计与制作

在微流控芯片的设计中，首先根据检测目标的大小以及微型气泵的通量设定芯片进样通道的宽度，并据此确定真菌孢子运动速度，而后根据孢子由运动态到静止态的临界速度以及非目标粒子的过滤量确定微流控芯片富集检测区的最优直径。在进入富集检测区之前，真菌孢子所受的拖拉力应大于真菌孢子所受摩擦力，以保证真菌孢子能够抵达富集检测区；当孢子运动至富集检测区时，孢子所受拖拉力应小于孢子所受摩擦力，致使孢子停留在富集检测区，且孢子根据其粒径与质量差异呈现分散排列。

为了满足微流控光电检测系统对真菌孢子的捕捉检测，设计了具有进样接口、进样通道、富集检测区、电动抽气接口的4级阵列式微流控芯片。其中微流控通道结构组成如图1a所示：1为直径为500m进样接口，在进样接口均接入方便采集空气中真菌孢子的软管，用于真菌孢子的采集进样。2为宽度为250m的进样通道。进样通道采用宽度固定、简约平缓的直通式设计，实现真菌孢子在通道内的无障碍运动，并方便芯片清洗，提高芯片的再利用率。3为富集检测区，富集检测区设计为直径为2000m的圆形腔室，此设计不仅实现孢子运动速度的缓降，使孢子有序排列于富集检测区；还与光纤出射透镜形成的圆形平行光斑相匹配，降低光源定位不准或斑径过大而引入的检测干扰及噪声。4为电动抽气接口，电动抽气接口接入微型气泵管道，抽气式设计相比吹气式设计，减少了收集孢子时的泵内损失。

1.孢子进样接口；2.进样通道；3.富集检测区；4.电动抽气接口

1.Spore inlet; 2.Injection channel; 3.Enrichment detection zone; 4.Electric pumping inlet

图1 微流控芯片

Fig.1 Microfluidic chip

试验利用热压法通过光刻、注塑、压印、键合等工艺制作微流控芯片。如图1b所示，由于使用聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane, PDMS）材料作为盖片，玻璃为键合基片，PDMS材料表面光滑平整、漫反射率低使得芯片的透光率高达95%，良好的透光性能够保证光电检测具有较好的灵敏度。图1b中，微流控芯片为四级阵列式微流控芯片。

1.2 微流控检测系统试验平台创建

图2为微流控芯片光电检测系统平台示意图。试验所涉及设备包括HR2000+ES型光谱仪（美国海洋光学公司）、海洋光学HL-2000-HP-FHSA型精密光源（美国海洋光学公司）、光纤支架、发射光纤探头、接收光纤探头、微流控芯片、微型气泵、电脑。

将微流控芯片放置在光电检测支架上，发射光纤探头一端与光源相连（将光源的光强与波长调制最佳状态），另一端安装在检测支架上方与微流控芯片的上表面相贴；检测支架下方安装接收光纤探头，接收光纤探头一端与微流控芯片下表面相贴，另一端与光谱仪相连，光谱仪输出的信号可直接在电脑上显示。另外，将通量为0.14 mL/min的微型气泵连接到抽气区，为微流控芯片收集空气中的真菌孢子提供进样动力。整个检测过程保持在暗室的条件下进行。

1.光源；2.光谱仪；3.微流控芯片；4.发射光纤探头；5.接收光纤探头；6.电脑；7.微型气泵；8.孢子；9.软管

1.3 试验材料与步骤

试验样本水稻稻曲病菌孢子是2017年8月由江苏农林职业技术学院于人工气候室内培养获得，试验利用气溶胶发生器可将孢子样本制作成气溶胶粒子，均匀释放在单位体积为1L的容器中。试验采取标准采样时间为5 min，利用显微图像法计算获得平均孢子浓度为1.5×103个/mm2，则此浓度为标准单位样品浓度，每隔5min进行一次检测。

首先，根据检测需要利用AutoCAD软件设计微流控芯片，并通过COMSOL Multiphysics 5.1仿真软件对所设计的微流控芯片进行仿真，得到满足真菌孢子富集需求的微通道结构后进行微流控芯片的制作。将制作好的芯片通过软管连接气泵并搭建如图2所示的系统检测平台。对样本进行吸气采集试验，在100 min内，分别每隔5 min采集一次试验数据。将未进行吸气采集时刻（即=0时刻）的透射光强作为入射光强（cd），=5 min及后续时刻测得的透射光强作为透射光强0（cd），此时，由于引起入射光强与透射光强0的差异性的唯一原因就是富集的病害孢子，因此，此方法可抵消因微流控芯片自身对光信号的反射或吸收所引起的误差问题，具体系统设计试验流程如图3所示。

图3 系统设计试验流程图

其次，试验利用搭建好的装置在不同光源光强及波长条件下对不同浓度的真菌孢子样本进行检测，根据检测灵敏度与光源光强及波长的关系确定最佳光源光强及波长值。

最后，将检测装置光源参数调节到通过试验优化得到的数值，建立真菌孢子浓度与吸光度的对应关系。

2 工作原理

2.1 孢子富集原理

当真菌孢子随空气气流进入微流控芯片通道时，通道对真菌孢子存在摩擦力f的作用，摩擦力f可表示为

式中为摩擦系数（本文中微流控芯片的静摩擦系数为0.8，滚动摩擦系数为0.34）；N是真菌孢子对芯片通道表面的压力（N）；来流速度为真菌孢子提供一个拖拉力Fr[30]（N），当Fr达到一定值时，孢子将克服静摩擦的作用，改变原始的运动状态随气流运动，由Stokes定律[31]可将拖拉力表示为：

式中为空气的动力黏度，N·s/m；p为真菌孢子粒径，m，试验设置孢子直径为6m；p为微颗粒中心处的气流速度，m/s；为了改变真菌孢子的运动状态并富集在富集检测区内，须将速度p控制在一定范围内。

当空气中的粒子运行到富集检测区时，由于富集检测区域变大，真菌孢子速度变慢，此时拖拉力Fr不足以克服摩擦力，孢子便会停留在富集检测区，这样就实现了真菌孢子的富集。

2.2 光检测原理

当光束穿过含有粒子的介质中，由于粒子具有散射和吸收作用，透射光强必定小于入射光强，衰减部分光强大小与粒子的大小和浓度有关，根据朗伯比尔定律[32]可知，入射光强度（）和透射光强度（0）满足以下关系

式中（m）和（m）分别是颗粒尺寸分布的下限和上限，为粒子直径随机量（m），为粒子群的分布、是尺度参数的概率分布，为粒子直径（m）。

而孢子的浓度v（个/m3）可表示为

将式（4）带入式（3）可得浓度与出射光强和入射光强的关系

3 结果与分析

3.1 富集检测区直径优选

微流控芯片结构的设计对实现真菌孢子的富集具有决定性的影响。根据目标粒子进入微流控芯片通道内所需速度大小范围以及所使用的微型气泵的通量进行计算，试验将进样通道固定设置为500m，确定真菌孢子运动的拖拉力，但此时富集检测区内的速度未知。为了使真菌孢子在富集检测区内有序富集，试验通过优化富集检测区的直径大小，改变富集检测区的速度分布，从而得到真菌孢子富集所需要的速度。

利用AutoCAD软件绘制出5组富集检测区直径分别为：1 000、1 500、2 000、2 500、3 000m的芯片结构图，通过COMSOL Multiphysics 5.1仿真软件对5组微流控芯片分别进行仿真，分析通道内的速度大小，所得芯片速度仿真分布图如图4所示，芯片内速度最大值分布图如图5所示。

注：富集检测区直径为2 000 μm。

试验根据OEK方法[33-34]推算出的单个稻曲病菌孢子的质量在pg级。以稻曲病孢子为检测对象，令Fr大于f，取静摩擦系数0.8对孢子克服摩擦力所需运动速度进行计算，结果显示，当芯片通道中速度大于0.346 m/s时孢子开始运动。而后孢子运动采用滚动摩擦系数0.34对孢子受力情况进行分析；令Fr小于f，即当芯片通道速度小于0.138 m/s时，孢子由运动状态转为静止状态，满足孢子富集需求。芯片根据孢子由静止到运动和由运动到静止所需速度对富集检测区的直径进行设置，由此使检测目标停留在检测区。并且水稻花粉质量在17 ng左右，此时试验所采用的速度不足以使花粉进入芯片，以此排除花粉对检测结果的干扰作用。

表1可看出测富集检测区的速度值，富集检测区的最小速度值随直径变大而减小。当富集检测区直径为2000m时，富集检测区的最小速度降至0.138 m/s，此时速度不仅满足孢子停滞需求，还可以支持质量及直径小于真菌孢子的杂质继续运动，降低杂质的富集率，提高装置检测精度，降低检测误差；当直径为2500m时，富集检测区的速度将降至0.107 m/s，此速度在满足真菌孢子富集需求的同时，还会将质量和直径小于孢子的部分杂质留在检测富集区，增大检测误差。由此可知，当直径为2000m时，装置检测误差最小，所以试验将富集检测区的直径设为2000m。图5为富集检测区以及富集检测区出口收集试验后的状态图像。由图5a可看出，孢子均匀留在检测富集区；图5b中无孢子或杂质残留迹象。进一步验证了微流控芯片的科学性。

表1 富集检测区不同直径对应不同的富集速度

注：富集检测区直径为2 000 μm，图a、b均放大100倍。

3.2 光源光强及波长筛选

试验利用光电检测方法对基于微流控芯片的孢子浓度进行检测时，系统条件参数主要包括光源光强及波长。因此试验通过光谱仪对不同浓度的孢子样品进行检测，并对检测结果进行分析，确定检测系统的较佳光源参数。其中，试验将孢子浓度公式定义为富集区单位面积的孢子数。

3.2.1 光源光强

由于孢子是半透明物质，光强过大或过小均会使检测系统灵敏度降低，只有确定最佳光强值，提高检测系统灵敏度，才能有效提高孢子浓度检测的准确率。因此在利用光电检测方法进行检测试验前，需先确定检测光源的光强大小。

首先，试验选取收集时间为0、5、10、20、30、40、50、60、70、80 min分别对应孢子浓度为0、1.5×103、3×103、6×103、9×103、1.2×104、1.5×104、1.8×104、2.1×104、2.4×104个/mm210组试验作为被测对象。其次，利用图2所示检测装置检测并记录不同光强下不同浓度的孢子样品对应的透射光强值。最后，选取波长为400，500，600，700 nm时，不同光强下不同浓度所对应的透射光强值，并计算出在4组波长值下在不同光强对应的灵敏度值，从而确定最佳检测光强。其中灵敏度定义为单位孢子浓度变化量导致透射光强的变化程度。试验选取光强作为横坐标，以灵敏度为纵坐标，测得的灵敏度如图6所示。

图6 光强优化效果图

由图6可知，当光源光强设置为1.1×104cd时，试验所搭建的基于富集微流控芯片的水稻菌病害光电检测装置灵敏度最高。

3.2.2 波 长

波长不同，试验的透射光强不同。只有找到最佳波长才能准确的反映孢子浓度和透射光强的关系。首先，试验设定光源光强值为1.1×104cd，以气泵工作10 min为间隔对应的真菌孢子浓度作为检测对象，检测并保存试验数据。其次，以光源波长为横坐标，以透射光强为纵坐标，建立不同孢子浓度在不同检测波长下对应检测浓度的分布图，如图7所示。当<1.5×103个/mm2时，光强试验检测曲线出现严重合状态，非线性程度较高，无法试现定量检测，因此依据标准样品浓度测量可得孢子在10 min富集条件下的检出限为1.5×103个/mm2。

由图7可知，对水稻稻曲病真菌孢子检测时，不同孢子浓度下不同波长值所对应的透射光强的不同，并且透射光强随孢子浓度的增大而减小。为了获取最佳检测波长值，试验选取波长值在450～750 nm，间隔为50 nm的波长进行线性相关系数及波长灵敏度的分析。波长与检测精度和检测灵敏度的对应关系如表2所示。

图7 不同孢子浓度在不同波长下对应的透射光强

由表2计算结果可知：在不同的波长条件下，透射光强与孢子浓度呈线性关系，波长为650 nm时系统测量形成的线性关系变化均匀显著，此时建立的线性关系更加真实有效的反映空气中的真菌孢子浓度。因此，此时系统的检测波长灵敏度最高为1.18×10-2cd/(个/mm2)，并且此时线性相关系数达到0.995 3，符合系统检测需求。因此，系统选择650 nm为检测光源的较佳检测波长。

表2 波长与灵敏度的对应关系表

3.3 性能分析与验证

论文以水稻稻曲病菌孢子标准样品为研究对象，利用固定目标对提出的基于富集微流控芯片的水稻稻曲病菌病害光电检测方法进行验证，根据朗伯比尔定律可知，吸收系数与稻曲病菌孢子的物质属性有关，所采用的吸收波长为稻曲病的特征吸收峰，对于其他类型病害，可以进一步筛选特征吸收峰。如果特征吸收峰有重合，则可采用双峰或者多峰复合建模，从而实现对特定目标的定量检测，也可利用该方法消除粒径相似物质对检测结果的干扰。此外，由于病害疫情的爆发同时需要气候、温度、湿度等多重因素的影响，因此，试验数据需结合环境条件才能实现对病害疫情的准确判断。论文以稻曲病菌孢子为检测对象得到检测曲线如图8所示，从图中可以看出，吸光度值随着孢子浓度值的增大而增大，近似呈线性关系。经线性拟合后得出对应的线性模型为：=6.147e-6+0.05188，线性相关系数为0.992 9，线性度较好，因此只需根据对应的孢子吸光度值的大小即可计算出对应的孢子浓度值。

图8 孢子浓度与吸光度关系图

为了验证系统检测的科学性与准确性，首先利用微流控芯片对水稻稻区病孢子进行富集试验；而后对富集好的微流控芯片进行光电检测及镜检，验证系统准确性。

试验主要通过将稻曲病孢子（直径5～6m，江苏农林职业技术学院提供）、稻瘟病孢子（直径2～2.5m，江苏农林职业技术学院提供）、空气中杂质（含PM2.5、PM10等物质）3种稻田环境主要组成物质进行混合，模拟水稻种植环境，对试验对象进行误差检测试验。试验利用气溶胶发生器将稻曲病孢子、稻瘟病孢子、空气中的杂质3种物质（分别取0.5 g）制备成质量浓度为1.5 g/L的气溶胶粒子，而后利用微流控芯片分别对制备气溶胶粒子进行为时30 min的收集试验。试验重复3次，最后经镜检计数得到的富集试验结果如表3所示。

表3 系统验证分析表

检测结果由表3所示，利用针对稻曲病孢子富集试验设置速度为0.346 m/s进行富集试验。结果证明：试验可过滤掉绝大多数的空气干扰物，富集的稻曲病孢子占收集物的85%以上，比较镜检值和检测模型测得粒子数值，结合系统检测模型误差值可看出，论文建立的基于水稻稻曲病菌孢子的检测模型误差小于17.5%。符合装置检测要求。

4 结 论

1）提出一种基于富集微流控芯片的水稻真菌病害光电检测方法，设计集孢子进样、富集检测、气体出气于一体的微流控芯片。

2）并对芯片微通道尺寸及进气速度进行优化，富集的稻曲病孢子占收集物的85%以上，降低空气中无关物质的富集，从而降低系统检测误差。

3）对检测系统的光源参数进行优化，检测光源光强为1.1×104cd，波长为650 nm时，根据吸光度与水稻稻曲病孢子浓度的关系建立检测模型，检测线性度达0.992 9，检测模型误差值小于17.5%，满足检测要求。

基于富集微流控芯片的水稻稻曲病菌病害光电检测方法为便携式病害预警系统的研发提供理论基础。对于尺度、质量相近的物质干扰问题有待进一步解决。

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Photoelectric detection method for false smut fungal spore based on enrichment microfluidic chip

Yang Ning1,2, WangPan1, ZhangRongbiao1※, Xu Peifeng1, Sun Jun1, Mao Hanping2

(1.212013,; 2.212013,)

The fungal disease of false smut is research focus, which can spread around within short time and cause much loss of rice yield. However, there hasn’t been any effective detection and prediction method. For this reason, we designed a set of sample interface, injection channel, enrichment detection area, electric pumping interface in one of the microfluidic chips. The sample interface is connected to the hose for the collection of fungal spores. The injection channel adopts the simple and gentle straight-through design with a fixed width, in order to achieve the barrier-free movement of the fungal spores in the channel, making it easy to clean the chip, and thus improving the recycle rate of the chip. The enrichment detection area is designed as a circular chamber. This design not only slows the drop rate of the spores, which therefore makes the spores arranged in the enrichment detection area efficiently, but it also matches the circular parallel light spot formed by the fiber output lens. In this way, we can reduce the interference and noise introduced by positioning the light source inaccurately and too large spot diameter. Electric suction interface accesses micro-pump pipeline, and compared to the inflatable design, the pumping design reduces the loss in the pump during the collection of spores. In order to make the fungal spores be arranged in the enrichment detection area correctly, the sample channel width was set in the experiment and the diameter of the enrichment detection area was optimized to meet the needs of fungal spore enrichment speed. The experimental results showed that the enriched detection zone had the best enrichment effect when the diameter was 2 000m. Then, a photoelectric detection system based on microfluidic chip was established in this paper. When the spore concentration of microfluidic chip was detected by photoelectric detection method, the system condition parameters mainly included light intensity and wavelength. Therefore, different concentrations of spores were tested by the spectrometer, and the results were analyzed to determine the optimal light source parameters of the detection system. The experiment was performed at the Jiangsu University Laboratory in April 2017, and the spores used in the experiment were obtained in the artificial climate room in Jiangsu Vocational College of Agriculture and Forestry. We used the spectrometer, fiber and other structures to build the experimental platform for light intensity and wavelength optimization. According to the principle of light detection and the characteristics of light attenuation formed by different concentrations of spores in the enrichment area, the detection intensity with high sensitivity was screened. Taking the detection of the sensitivity performance of the spectrum as the target and considering the linearity, the detection wavelength was determined; the best light intensity was at 1.1×104cd and the best wavelength was 650 nm. Finally, with strawberry grey mold spores as the object, we conducted an automated microfluidic chip enrichment and photoelectric detection experiment, and established a curve of spore concentration and absorbance based on the principle of enrichment and photo-detection. The experimental results showed that the detection method we proposed had a linear correlation coefficient of 0.992 9. The method of photoelectric detection of false smut fungal disease based on microfluidic chip realizes the efficient detection of spores concentration, which provides a theoretical foundation for the development of portable false smut disease detection equipment.

diseases; sensitivity analysis; models; microfluidic chip; fungal; photoelectric detection

10.11975/j.issn.1002-6819.2017.20.020

S124.3

A

1002-6819(2017)-20-0161-08

2017-07-14

2017-10-09

国家自然科学基金（61673195, 31701324）；江苏省高校优势学科建设工程资助项目（PAPD）（苏政办发[2011]6号）；中国博士后特别资助项目(2015T80512)；江苏省自然科学基金项目（BK20140550）

杨 宁，河南人，讲师，博士，主要从事微传感与自动化检测技术。212013。Email：yangn@ ujs.edu.cn

※通信作者：张荣标，江苏人，教授，博士，主要从事计算机智能检测技术、信号信息处理、无线传感网络。Email：zrb@ujs.edu.cn

杨 宁，王 盼，张荣标，徐佩锋，孙 俊，毛罕平. 基于富集微流控芯片的稻曲病菌孢子光电检测方法[J]. 农业工程学报，2017，33(20)：161－168. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2017.20.020 http://www.tcsae.org

Yang Ning, Wang Pan, Zhang Rongbiao, Xu Peifeng, Sun Jun, Mao Hanping. Photoelectric detection method for false smut fungal spore based on enrichment microfluidic chip[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2017, 33(20): 161－168. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2017.20.020 http://www.tcsae.org