Chelex-100法和硅珠法在玻璃指纹DNA检验中的比较研究*

雒彩虹 亓 兵 于 浩

1.江苏警官学院，江苏 南京 210031；2.南京市公安局浦口分局，江苏 南京 210000；3.南通市海安县公安局，江苏 南通 226601

Chelex-100法和硅珠法在玻璃指纹DNA检验中的比较研究*

雒彩虹1亓 兵2于 浩3

1.江苏警官学院，江苏 南京 210031；2.南京市公安局浦口分局，江苏 南京 210000；3.南通市海安县公安局，江苏 南通 226601

目的：探讨chelex-100法与硅珠法两种提取方法在玻璃指纹DNA检验中的比较应用。方法15名志愿者分别在载玻片和模拟现场窗玻璃上的指纹采样，两组采样均分别用Chelex-100法与硅珠法提取，进行STR复合扩增和基因分型分析。结果在载玻片上的指纹，Chelex-100法检出率要高于硅珠法的检出率。在模拟现场玻璃上的指纹，两种方法的检出率都相对较低，但是硅珠法要稍高于chelex-100法。结论针对相对较干净的汗潜指纹建议采用chelex-100方法进行提取扩增，避免硅珠法在提取过程中的损失；遇到检材较差的汗潜指纹应用硅珠法效果会好于chelex-100法，并且建议进行多次平行扩增。

法医物证学；提取方法；STR分型；汗潜指纹

在实际案件中现场遗留的检材多数是痕量DNA检材，导致PCR扩增时只拥有低拷贝DNA模板[1]，而现阶段玻璃上汗潜指纹DNA模板是公安实际工作中比较常见的。汗潜指纹指的是含有手指脊线分泌的脊线汗或粘有脸部皮肤皮脂汗的手指末端与客体接触后，留下肉眼不能直接看见的指纹印迹[2]。汗潜指纹是在犯罪现场中比较常见的痕迹检验的物证，也是痕迹检验的重要检测和研究对象。汗潜指纹中存在有比较微量的脱落细胞[2]。现如今随着DNA检测技术的快速发展，已经实现了DNA检测的微量化，让我们对汗潜指纹DNA的检测成为了可能。但是在基层相关汗潜指纹的DAN检验中，由于实际案件中遇到的指纹情况比较复杂，前期高效高质量的提取过程对于后期等位基因的检出率起到了至关重要的作用，在实践过程中，只有找到最合适有效的方法，才能为后续的检验工作打下扎实的基础。本文通过对模拟玻璃上汗潜指纹DNA的检验，初步探讨实际案例中遇到相似检材时的首选检验方法，为实际案例检验提供指导方案。具体将进行两种现场的模拟，一种为载玻片上汗潜指纹的模拟，另外一种为实验室窗户外侧玻璃上的汗潜指纹的模拟，然后分别采用Chelex-100法和硅珠法分别对模拟的汗潜指纹进行提取、扩增、检测，分析统计两种不同提取方法，对等位基因检出率情况进行总结，进而达到比较优劣的情况。

一、材料与方法

(一)样本

15名志愿者分别双手食指、中指、无名指以约1.5kg的力度按压在载玻片上，时间大约5s，24小时后同一时间同样的方法按压在实验室窗户外侧玻璃上。按压在载玻片上的统一归为A组，按压在实验室窗户外侧玻璃上的统一归为B组。A组中所有15名志愿者左手共45枚指纹分别标为A1、A2……A45，A组中所有15名志愿者右手共45枚指纹标为A1-2、A2-2……A45-2。B组中所有15名志愿者左手共45枚指纹分别标为B1、B2……B45，B组中所有15名志愿者右手共45枚指纹分别标为B1-2、B2-2……B45-2。

(二)提取方法

A组中45枚指纹A1、A2……A45和B组中45枚指纹B1、B2……B45分别用Chelex-100方法提取[3]，A组中45枚指纹A1-2、A2-2……A45-2和B组中45枚指纹B1-2、B2-2……B45-2分别按照硅珠法进行提取[4-5]。其中Chelex-100法中用20μl体系，硅珠法中用20μl进行洗脱。均快速离心后进行扩增。

(三)扩增体系

本实验采用的是美国ABI公司生产的AmpFlSTR Identifiler Plus试剂盒(即ID Plus)，ID Plus试剂盒所采用的是ABI公司(美国应用生物系统公司)的五色荧光技术，能够实现16个STR位点同时扩增、检测。ID Plus试剂盒包括全部16个位点PCR扩增所需要的引物(Primer set)，Taq酶，PCR扩增试剂(Mix)以及阳性对照9947A。

本实验采用的扩增体系(见表1)。

因为DNA模板量较少，我们其他条件不变，将循环次数改为30次[6]，具体步骤为95°C热启动11min，94°C变性20s，59°C退火和延伸3min，变性、退火、延伸循环30次，60°C延伸10min，最后4°C恒温保存。

(四)等位基因检测

利用移液器吸取1.5μl的扩增液至另一个96孔板中，再按照一定的比例加入Liz500和HIDI溶液，并设置两个Ladder，最后放入3500XL基因分析仪中进行分析，利用Genemapper ID-X软件测定样品片段大小与同一凝胶或一批加样的等位基因分型标准物(Ladder)比对，进行基因分型。

二、结果

根据AmpFlSTR Identifiler Plus试剂盒用户手册中推荐的PCR扩增循环数为28次循环，推荐体系为25μl体系，可有效检出的最低模板量为0.05ng，即模板DNA量大于等于0.05ng时，DNA检测结果能够明确判读；而当模板DNA量低于0.05ng时，检测结果则无法正确判读。本文中采用国内通用的扩增体系10ul进行扩增，并增加2个循环数进行扩增。然后利用3500XL进行检测。本实验采用纯合子大于150荧光单位，杂合子大于75个荧光单位进行判读，低于此标准不进行统计。

表2 A组实验结果分析

表3 B组实验结果分析

(一)扩增体系对汗潜指纹DNA影响

汗潜指纹DNA属于微量检材，其含有较低浓度的DNA分子，故我们将其循环数增加2个，以增加DNA的检出率，增加2个循环数对DNA的非特异扩增及不平衡扩增影响不大，但可以有效增加DNA浓度。

(二)2种方法的实验结果比较

由表2可知，在载玻片上的模拟汗潜指纹，Chelex-100法检出率要高于硅珠法的检出率，分析其原因chelex-100法对检材没有损耗，而硅珠法步骤相对繁琐，再加上DNA分子量少时，硅珠结合率也不高，致使此结果的出现。因此我们认为在公安实际工作中遇到案发现场遗留在玻璃制品上的相对干净的残缺汗潜指纹采用Chelex-100法效果要相对较好。

在模拟实际现场玻璃外侧指纹的检测时，两种方法的检出率都相对较低，但是总的来讲硅珠法要稍高于chelex-100法，分析原因可能为现场检材中有较多的灰尘等杂质，硅珠法能有效的去除这些抑制物，而chelex-100法虽没有损耗，但是对于这些抑制物确无法进行去除，直接影响了DNA的扩增效率，影响到了检测结果。对实际情况中遇到检材较差的汗潜指纹应用硅珠法效果会好于chelex-100法，并且建议进行多次平行扩增，可以得到部分完整的DNA分型。

三、讨论

本实验中采用了两种提取方法，并且分别对两种不同的模拟汗潜指纹进行了提取与检测。汗潜指纹中的DNA含量不同的人相差很大，这和个体因素有很大关系，本试验中有的个体无论是模拟载玻片上的汗潜指纹还是模拟实验室窗户外侧玻璃上的汗潜指纹，DNA检出率都相对较高，而有一名志愿者无论哪种方式，均未获得等位基因。这种个体之间的差异和本人的代谢水平有直接联系，对于代谢旺盛，出汗较多的个体相对检出率要高，而对于那些代谢水平较低的检出率也低。在实际公安工作中，好多盗窃嫌疑人的心理素质也很重要，对于那些惯犯，心理素质强的，检出率同样较低，而那些心理素质差，新手，盗窃财物时比较紧张的检出率也较高。本实验未考虑个体之间的差异以及其心理素质等方面的问题，如有可能，可以对这几方面进行深入研究。不过通过对本次实验的设计，笔者认为以后对这种微量的汗潜指纹DNA可以进行多次平行扩增，以期待能得到好的结果。

在实际公安工作中，较干净的汗潜指纹碰到的比较少，笔者在实际工作中提取到的较干净的指纹一般是嫌疑人翻动受害人家中玻璃制品时留下的残缺指纹，对这类相对较干净的汗潜指纹建议采用chelex-100方法进行提取扩增，避免硅珠法在提取过程中的损失，得出完整分型的可能性要大于硅珠法。而对于受害人室外玻璃上较脏的残缺指纹建议采用硅珠法进行提取，因为这类检材中含有较多的杂质，会影响扩增效率，硅珠法的最大优点就是可以有效的除去这类杂质，减少对扩增效率的影响。针对汗潜指纹这种微量检材进行相应的平行扩增，对增加得到完整DNA图谱的概率有很大帮助。

[1]GILL P.Application of low copy number DNA profiling[J].Croatian Medical Journal，2001，42(3)：229-232.

[2]王桂强.指印的光学显现和照相技术[M].北京：群众出版社，2001.25.

[3]WalshBS，MetzgerDA，HiguchiR.Chelex-100 asmedium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material[J].Biotechnics，1991，10(6)：506-513.

[4]Stacy FR，Jakonbsen.Reliable nonivnasive genotyping based on excremental PCR of nuclear DNA purified with a magnetic bead protocol[M].Molecular Ecology，1999，8(5)：879.

[5]郑秀芳，凌凤俊，涂政，等.模板DNA磁珠提取法[J].中国法医学杂志，2003，18(2)：107.

[6]GillP，WhitakerJ，FlaxmanC，etal.An investigation of the rigor of interpretation rules for STRs derived from less than 100pg of DNA[J].Forensic Science International，2000，112(1)：17-40.

ComparativestudyofChelex-100andsiliconbeadmethodinDNAinspectionofglassfingerprints

LUO Cai-hong，QI Bing，YU Hao

1.Jiangsu Police Institute，Nanjing 210031，China；2.Nanjing Public Security Bureau Pukou branch，Nanjing 210000，China；3.Haian County Public Security Bureau of Nantong，Nantong 226601，China

Objective:To compare the two extraction methods of Chelex-100 and silicon beads in DNA examination of glass fingerprints.MethodsThe fingerprints of 15 volunteers were sampled on slides and simulated window glass，and two groups of samples were extracted by Chelex-100 and silica beads，respectively.STR amplification and genotyping were performed.ResultsIn the slide fingerprints，the detection rate of Chelex-100 was higher than that of silica beads.in the glass fingerprints of the simulation field，the detection rate of the two methods is relatively low，but the silicon beads should be slightly higher than the Chelex-100 method.ConclusionFor the relatively clean sweat latent fingerprints，Chelex-100 method is suggested to extract and amplify，avoiding the loss of silicon beads in the extraction process；When the sweat fingerprints are poor，the bead method is better than the Chelex-100 method，and multiple parallel amplification is recommended.

Forensic biological evidence；Extraction method；STR typing；Sweat latent fingerprints

*江苏警官学院院级青年科研项目“基层公安机关DNA实验室规范性建设研究”(2014SJYZQ02)。

D919

A

2095-4379-(2017)32-0049-03

雒彩虹(1983-)，女，硕士研究生，江苏警官学院刑事科学技术系，助教，研究方向：法医物证。