索氏法提取和测定油茶籽油的条件优化

,,,明怀

(1.广东省森林培育与保护利用重点实验室,广东广州 510520; 2.广东省林业科学研究院,广东广州 510520)

索氏法提取和测定油茶籽油的条件优化

王静1,2,张盟雨1,2,张应中1,2,王明怀1,2

(1.广东省森林培育与保护利用重点实验室,广东广州 510520; 2.广东省林业科学研究院,广东广州 510520)

除富含不饱和脂肪酸的茶油外,油茶中还含有茶多糖、茶皂素、茶多酚等多种生物活性成分。以油茶生物活性物质的提取和制备为前提,本研究以简单、有效地提取茶油为目标,以油茶籽含油率为指标,在索氏抽提法单因素实验基础上,选择提取时间、提取温度、提取溶剂种类和单次样品重量为影响因素进行正交优化实验。结果表明,油茶索氏提取的最佳条件为:提取时间6 h、提取温度80 ℃、有机溶剂丙酮、单次样品重量4 g。该条件下茶籽含油率达43.24%±0.53%。该条件下测得4种油茶整籽和种仁的含油率从高到低依次为广宁红花油茶、普通油茶、小果油茶和高州油茶;广宁红花油茶的整籽和种仁含油率均最高,且饼粕含油率最低,分别为49.7%、67.5%和6.1%。优化后的油茶索氏抽提条件,适用于茶油成分的有效提取和针对油茶籽油的定量分析。

索氏抽提法,油茶籽油,提取,测定

油茶(Camelliaoleifera)属山茶科山茶属,常绿小乔木或灌木,是中国南方重要的经济林木,也是我国特有的多年生木本油料作物[1-2]。油茶籽可榨油供食用,茶油营养成分丰富,脂肪酸结构合理,富含油酸和亚油酸等不饱和脂肪酸,且不饱和脂肪酸含量达90%以上[3],其相对质量分数高于橄榄油[4-5]。是一种健康型高级食用油[6],还被广泛应用到医药、化妆品、工业制造等其他领域[4,7-11]。此外,油茶中含有大量的生物活性成分,如油茶多糖[2,12]、茶多酚[13-14]、茶皂素[15]、茶多肽[16]等。且在橄榄中不存在的茶多酚和茶皂素,分别具有降低胆固醇和溶血栓等功能[17],因此油茶活性物质具有极大的研究价值。

油茶活性物质的研究首先需在保留其生物活性的前提下,进行提取和测定,因此油茶活性物质提取过程中研究茶油的有效提取和准确测定具有必要性。目前,茶油的提取方法主要有有机溶剂浸出法、水代法、水酶法、超临界CO2萃取法、压榨法等[18],油茶含油率测定方法有索氏抽提法[19]、折光指数测定法[20]、近红外光谱法[21]、核磁共振检测技术[22]等,索氏抽提法能够满足油脂的提取[23-25]和含油率的测定[3,20]。本研究以简单、经济、有效地提取茶油组分为目标,在传统的索氏抽提测定植物油脂基础上进行条件优化,并测定4种油茶含油率,为油茶活性物质的提取与制备提供前期基础。

1 材料和方法

1.1材料与仪器

普通油茶、广宁红花油茶、小果油茶、高州油茶 分别由广东省韶关市曲江区小坑国营林场、广宁康帝公司、广东省兴宁市林业科学研究所、广东省高州市林业科学研究所提供,均为2015年11月～12月采收成熟的油茶籽,部分压榨成饼粕;无水乙醇 广州化学试剂厂;石油醚(沸点60～90 ℃) 天津化学试剂厂;丙酮、无水乙醚、乙酸乙酯、正己烷 天津市大茂化学试剂厂。

AR423CN千分之一电子天平 奥豪斯仪器(常州)有限公司;SXT-06索氏抽提器三台和HWS-26数显恒温水浴锅 上海洪纪仪器设备有限公司;DHG-9240X电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司;AWL-1001-U超纯水系统 美国艾科浦国际有限公司;SB-5200DTN超声波清洗机 宁波新芝生物科技有限公司;超速离心机 德国Eppendorf公司。

1.2原料预处理

利用高速粉碎机将油茶整籽、种仁和饼粕粉碎成小颗粒后,用60目筛去除大颗粒。过筛后经75 ℃烘干至恒重,分装于密封袋中,室温保存、干燥备用。

1.3实验方法

1.3.1 单因素实验设计 普通油茶籽为原料,采用索氏抽提法,分别对提取时间(2、4、6、8、10、12 h)、提取温度(60、65、70、75、80、85 ℃)、有机溶剂种类(无水乙醇、石油醚、正己烷、乙酸乙酯、丙酮、无水乙醚)、单次样品重量(1、2、4、6、8、10 g)四个因素分别进行单因素实验,重复3次取平均值,考察各个因素对普通油茶籽含油率的影响,测定提取前、后普通油茶籽质量并计算其含油率。

1.3.2 正交优化实验设计 单因素实验表明,索氏抽提法提取茶油组分时,提取时间、提取温度、有机溶剂种类和单次样品重量对含油率均有不同程度的影响。普通油茶籽为原料,根据单因素实验结果和正交实验原理为基础进行4因素4水平实验L16(44)(每组三平行),以确定索氏抽提对普通油茶籽含油率的最佳条件。实验设计因素与水平见表1。

表1 正交实验设计因素与水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal experiments

1.3.3 验证实验 分别通过二次提取和无水乙醚提取对比实验,以验证正交优化实验的最佳提取条件的科学性。

1.3.3.1 二次提取 采用正交实验的最佳优化条件,进行连续两次索氏提取,计算第二次含油率,对正交优化实验结果进行验证。

1.3.3.2 无水乙醚提取 索氏法提取许多植物油脂的最佳有机溶剂为无水乙醚[26-29],本研究以普通油茶籽为原料,最佳提取条件下的索氏抽提含油率,与以无水乙醚为有机溶剂的索氏抽提含油率进行比较,以验证正交优化实验结果。

1.3.4 油茶含油率测定 在优化后的索氏抽提条件下,分别对普通油茶、广宁红花油茶、小果油茶和高州油茶的整籽、种仁和饼粕含油率进行测定和对比。

1.3.5 计算方法 采用称量法测定样品质量,以计算油茶含油率。

式中，G1:索氏抽提前的样品质量,g;G0:索氏抽提后的样品质量,g。

1.4数据处理

采用Excel 2010和GraphPad Prism 7软件对实验数据进行差异分析和作图。

2 结果与分析

2.1索氏抽提法的单因素实验

2.1.1 提取时间对索氏法提取和测定茶油的影响 在抽提温度75 ℃、有机溶剂石油醚、单次样品重量10 g的条件下,以普通油茶籽为原料,对提取时间(2、4、6、8、10、12 h)进行单因素分析。由图1可知,随着提取时间(2～12 h)的延长,传质逐渐达到平衡,含油率提高,提取时间为6 h时含油率趋于稳定;随后增加提取时间,含油率增长缓慢。其原因可能是随着提取时间的延长,油茶籽中的油脂逐渐被有机溶剂溶解析出,在6 h以后茶油几乎被完全提取。通过单因素方差分析得知,在6 h后差异不显著(p>0.05),因此选择提取时间为6～12 h作为正交优化实验的因素值。

图1 提取时间对含油率的影响Fig.1 Effect of extraction time on oil content

2.1.2 提取温度对索氏法提取和测定茶油的影响 在抽提时间8 h、有机溶剂石油醚、单次样品重量10 g的条件下,以普通油茶籽为原料,考察温度(60、65、70、75、80、85 ℃)对索氏法提取茶油的影响,结果如图3所示。在温度60～85 ℃时,含油率随提取温度的升高而提高,含油率在80 ℃时达到平衡点;当温度继续升高时,含油率没有显著变化(p>0.05)。这可能是因为温度的升高加快了分子间的热运动,进而加快溶质的扩散和溶剂的渗透[30-31],提高了茶油在石油醚中的溶出速度;但当油脂分子热运动加剧到一定程度,提取温度的升高则很难继续提高含油率[32-33]。考虑到油茶生物活性物质的变性温度,因此将提取温度设定在65～80 ℃范围作为正交优化实验的因素值。

图2 提取温度对含油率的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on oil content

2.1.3 有机溶剂种类对索氏法提取和测定茶油的影响 在抽提时间8 h、提取温度75 ℃、单次样品重量10 g的条件下,以普通油茶籽为原料,分别选取无水乙醇、石油醚、正己烷、乙酸乙酯、丙酮和无水乙醚作为有机溶剂进行单因素实验。由图3可知,不同有机溶剂对油茶籽油的溶解性不相同,丙酮和无水乙醚分别为有机溶剂时,普通油茶籽的含油率最高,其次分别是石油醚、乙酸乙酯和正己烷,最后无水乙醇为溶剂的含油率最低。无水乙醚极易挥发且低浓度可致人昏迷,不适合作为实验试剂长期使用[3],因此选择石油醚、乙酸乙酯、丙酮和正己烷四个水平作为正交优化实验的因素值,这与杨柳[3]的实验结果基本一致。

图3 有机溶剂种类对含油率的影响Fig.3 Effect of extraction solvent kinds on oil content

2.1.4 单次样品重量对索氏法提取和测定茶油的影响 在抽提时间8 h、提取温度75 ℃、有机溶剂石油醚的条件下,以普通油茶籽为原料,分别以1、2、4、6、8、10 g的单次样品重量为影响因素进行3平行实验,结果如图4所示。随着单次样品重量(1～10 g)的增加,含油率先稍有增加后迅速下降;单次样品重量为4 g时,含油率最高。其原因可能是抽提瓶内空间有限,单次样品重量影响抽提瓶内油茶籽与有机溶剂的传质速率,进而影响茶油在溶剂中的溶解效率。单次油茶籽重量较低,石油醚对茶油的提取率降低;单次油茶籽重量过高,抽提瓶内油茶籽与石油醚接触面积受限,茶油在特定时间内不能完全溶解进石油醚,因此计算后的含油率结果降低。通过单因素方差分析得知,在单次样品重量≤2 g时含油率差异不显著(p>0.05),因此选择单次样品重量为2～8 g作为正交优化实验的因素值。

图4 单次样品重量对含油率的影响Fig.4 Effect of weight of single sample on oil content

2.2索氏抽提法的正交优化实验

根据单因素实验结果,不考虑因素之间的交互作用,选取提取时间、提取温度、有机溶剂种类和单次样品重量4个因素,各取4个水平(表2),进行正交实验设计,结果和分析见表2和表3。

表2 正交实验设计与结果Table 2 Experiment design and corresponding results of orthogonal design

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

注：F0.05(3,4)=9.12;*,差异显著p<0.05。

极差大小可用来衡量实验中各因素作用的大小,极差值越大,说明显著性越高,反之说明显著性越低[34]。由表2可知,4个因素对索氏法提取和测定茶油的影响顺序为C>B>A>D,即依次为有机溶剂种类、提取温度、提取时间、单次样品重量。空列极差反应因素之间的交互作用,当某因素极差大于空列极差,表明该因素的效应存在[34],空列极差是判断实验各因素效应是否可靠的界线。因素有机溶剂种类和提取温度的极差(分别为26.34和11.42)均大于空列极差(11.38),说明有机溶剂种类和提取温度是影响索氏法提取和测定茶油的主要因素,且有机溶剂种类对实验的影响明显比时间因素大。最优组合为A1B4C3D2,即有机溶剂丙酮、提取温度80 ℃、提取时间6 h、单次样品重量4 g。

由表3可知,有机溶剂种类对索氏法提取和测定油茶籽油结果有显著性影响(p<0.05),提取时间、提取温度和单次样品重量对含油率结果无显著性影响。在此条件下,进行重复实验,得到的普通油茶籽含油率达43.24%±0.53%。

2.3验证实验

为了进一步验证正交优化实验结果的可靠性,分别进行二次提取和无水乙醚提取比较实验。首先,在最佳优化条件下,分别对普通油茶籽、广宁红花油茶籽、小果油茶籽和高州油茶籽进行连续两次提取,索氏法测定油茶籽第二次含油率均低于4.10%,仅为第一次含油率的0%～9.5%。因此,方法优化后的提取条件对油茶籽油的提取率达90.5%以上。与《GB/T 14488-2008 植物油料 含油量测定》的三次抽提(4 h+2 h+2 h)相比,不仅缩短了抽提时间(总6 h),也减少了索氏抽提次数,降低了工艺成本和时间。其次,普通油茶籽为原料,无水乙醚为有机溶剂的含油率为37.21%±0.15%,最佳优化条件下的含油率为43.24%±0.53%。因此优化后的条件达到了快速、简单、有效提取茶油组分的目的。

2.4四种油茶含油率的测定

利用正交实验的最佳提取油茶籽油的条件,分别测定和比较普通油茶、广宁红花油茶、小果油茶和高州油茶整籽、种仁和饼粕的含油率,结果见表4。

由表4可知,4种油茶整籽和种仁中,广宁红花油茶的含油率最高,分别为49.74%±0.68%和67.54%±0.33%;其次为普通油茶,其整籽和种仁的含油率分别为43.24%±0.53%和55.29%±0.17%;第三为小果油茶,其整籽和种仁含油率分别为32.04%±1.12%和51.91%±0.38%;高州油茶整籽和种仁的含油率最低,分别为19.88%±0.42%和44.42%±1.95%。饼粕是茶油生产过程中的副产物,其含油率从低到高分别为广宁红花油茶(6.13%±0.26%)、小果油茶(6.67%±0.19%)、高州油茶(11.10%±0.58%)和普通油茶(12.32%±0.36%)。

表4 四种油茶整籽、种仁和饼粕含油率的测定Table 4 Determination of four kinds of Camellia oleifera whole seeds,seed kernels and seed cakes

3 结论

在单因素实验的基础上通过正交实验，确定索氏法提取和测定茶油的最佳条件为:提取时间6 h、提取温度80 ℃、有机溶剂种类丙酮、单次样品重量4 g。验证实验表明,该条件下油茶籽油的提取率达90.5%以上,实现了简单、有效地提取茶油成分的目的。茶油组分的高效提取将有利于油茶活性物质提取和制备工艺的深入研究。

在优化后的提取条件下分别测定普通油茶、广宁红花油茶、小果油茶和高州油茶的含油率。整籽和种仁的含油率从高到低分别为广宁红花油茶、普通油茶、小果油茶和高州油茶。本研究根据国标《GB/T 14488-2008植物油料 含油量测定》以及以往研究对植物油脂的测定条件进行了摸索优化,建立了较优的油茶籽和饼粕含油率的测定条件,适用于对油茶籽油的定量分析。

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OptimizationofsoxhletextractionmethodforextractionanddeterminationofCamelliaoleiferaseedoil

WANGJing1,2，ZHANGMeng-yu1,2，ZHANGYing-zhong1,2，WANGMing-huai1,2

(1.Guangdong Provincial Key Laboratory of Silviculture,Protection and Utilization,Guangzhou 510520,China; 2.Guangdong Academy of Forestry,Guangzhou 510520,China)

In addition to high concentrations of unsaturated fatty acids inCamelliaoil,Camelliaoleiferaalso contains polysaccharides,saponins,polyphenols and other bioactive ingredients. On the premise of the extraction and preparation of bioactive substance fromC.oleifera,with simple and effective extraction of oil as the goal in this study,oil content as index,the orthogonal design was carried out to investigate the effect of extraction time,extraction temperature,extraction solvent kinds and weight of single sample after single factor test with soxhlet extraction method. The results showed that the optimum conditions of soxhlet extraction were as follows:extraction time 6 h,temperature 80 ℃,organic solvent acetone,single sample weight 4 g. Under this condition,the content ofC.oleiferaseed oil was more than 43.24%±0.53%. The oil contents of both whole seeds and seed kernels from high to low were followed byC.semiserrataChi,C.oleiferaAbel,C.meiocarpaHu andC.gauchowensisChang. The highest oil contents of both whole seeds and seed kernels were fromC.semiserrataChi,while oil content of seed cakes was the lowest,which were 49.7%,67.5% and 6.1%,respectively. The optimized soxhlet extraction conditions were applicable for the effective extraction and the quantitative analysis ofC.oleiferaseed oil.

soxhlet extraction;Camelliaoleiferaoil;extraction;determination

2017-03-03

王静(1986-)，女，博士，主要从事植物活性物质方面的研究，E-mail：wangjingmos@hotmail.com。

广东省林业科技创新项目(2017KJCX003)；广东省省级科技计划重点项目(2015B020202002)；广东省省级科技计划项目(2014A020208043)。

TS224

A

1002-0306(2017)21-0042-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.21.009